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大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法與注意事項

閱讀：2542發(fā)布時間：2011-4-22

　　
　　名稱：大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
　　（一）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
的原理：
　　所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）zui易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。細(xì)胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細(xì)胞是制備感受態(tài)細(xì)胞和進(jìn)行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時，可加入占總體積15%的無菌甘油或-70℃保存（有效期6個月）。cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬倍，而Ca2+也可大大促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用。在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個較普遍的現(xiàn)象，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系，另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關(guān)系。重組DNA分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主（受體）細(xì)胞，使之無性繁殖并表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。
　　（二）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
　?。?）質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度：
　　用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實驗證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10~100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。
　?。?）感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量：
　　所用的CaCl2等試劑均需是zui高純度的，并用zui純凈的水配制，分裝保存于4℃
　　（3）細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度
　　從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4℃的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600控制。對TG1菌株，OD600為0．5時，細(xì)胞密度在5×107個/ml左右。（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。
　　（二）感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的影響：
　　整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。整個操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會降低。
　　

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