ELISA實(shí)驗(yàn)操作中常見問題--試劑的影響：
ELISA 診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來衡量ELISA 反應(yīng) 試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類 試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。也有廠家堅(jiān)持 試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)地對(duì)待反應(yīng)結(jié)果?；蚬こ炭乖^合成肽抗原有*的*性，就HCV-ELISA 試劑盒來講，*代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV 特異性抗原。第三代 試劑的敏感度大大提高了。基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別如下：
基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或 酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：
a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。
b.穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使 試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的 試劑盒效期只有3-4 個(gè)月，采用基因工程抗原后效期大大延長(zhǎng)了。
c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高 試劑盒的靈敏度，提高檢出率。
d.純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g(shù)難度較大。
合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點(diǎn)：
a.分子量太小；
b.一般只含有一個(gè)抗原決定簇；
c.純度高；
d.穩(wěn)定性差。
國(guó)內(nèi)乙肝兩對(duì)半試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為 89.4%—99.3%,78%—89%存在較大差異。有的廠家酶標(biāo)板孔間A值差大于15%；標(biāo)記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差。使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。因此。選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。
• 選擇試劑時(shí)應(yīng)選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、批間差小、操作方便省時(shí)的優(yōu)良檢測(cè)試劑，國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室每年對(duì)各廠家的試劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估并定期公布評(píng)估結(jié)果，可作為選擇試劑的主要依據(jù)。
• 要注意試劑的批號(hào)和出廠日期，雖然試劑的有效期多為 1年。選擇剛出廠的試劑使用。
不同廠家的試劑不能混用。
不同方法學(xué)的檢測(cè)試劑，會(huì)使兩對(duì)半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實(shí)際工作中常用 ELISA檢測(cè)HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)為陽(yáng)性。除方法學(xué)的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對(duì)變異抗原或亞型乙肝標(biāo)志物檢測(cè)存在差異，建議試劑廠家對(duì)劑的制備應(yīng)該考慮亞型及型濃度的問題。
人elisa試劑盒
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