C1q放射免疫測(cè)定法

心得 （0）

實(shí)驗(yàn)試劑

CFD稀釋液（即VBS），10%三氯醋酸，C1q溶液

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

PEG（MW6 000），離心機(jī)

實(shí)驗(yàn)步驟

1. C1q標(biāo)記法C1q的同位素標(biāo)記，一般用125I，也可用131I。

125I的標(biāo)記有兩種方法，即氯胺T法和乳過(guò)氧化物酶法。下面介紹氯胺T法：
   1） 在100μl C1q（1mg/ml）中，加入100μCi125I，混勻，然后加入25μl 0.4mol/L PB（pH值7.4，含1mg氯胺T），冰浴中攪拌4～6min；

   2） 立即加入50μg/μl偏重亞硫酸鉀中止反應(yīng)，再加入50μl 1%牛血清白蛋白作為載體蛋白；

   3） 過(guò)Sephadex G25柱（20cm×0.5cm，預(yù)先用pH值7.4、0.4mol/L PB平衡，并注入1ml 1%牛血清白蛋白），以與游離125I 分開(kāi)；

   4） 以適當(dāng)濃度分裝后，放-70℃保存。為減少自身凝集，加入0.02%Tween20。

2. 取標(biāo)記好的C1q，用CFD稀釋到1mg/ml。

3. 7 000r/min離心30min（4℃），除去不溶性凝聚蛋白，上清液存放于4℃。

4. 取試管4支，每管加測(cè)定血清0.2ml，CFD 0.2ml，標(biāo)記C1q 50μl（1μg/ml）。1、2管為測(cè)定管，3、4管為對(duì)照管。

5. 搖勻后，放25℃溫箱60min，取出再放4℃冰箱60min。

6. 各管加3ml PEG，zui終濃渡為2.5%，搖勻后，放4℃ 2h。

7. 3、4管加10%三氯醋酸，沉淀所有的蛋白。將4個(gè)管都以1 000r/min離心20min，去上清液，沉淀物放γ計(jì)數(shù)器內(nèi)測(cè)cpm。

8. 計(jì)算

B=（a加b2加c加d2）×100

B：標(biāo)記C1q結(jié)合量（%）。a、b：1、2管（測(cè)定管）cpm。c、d：3、4管（對(duì)照管）cpm。