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   ELISA技術(shù)的-操作要點(diǎn)

優(yōu)質(zhì)的試劑,良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異,國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)一般均用板式點(diǎn).本文將敘述板式注意要點(diǎn),要詳細(xì)的使用說明,嚴(yán)格遵照規(guī)定操作,必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果.

    1 標(biāo)本的采取和保存

可用作 ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛,體液（如血清）,分泌物（唾液）和排泄物（如尿液,糞便）等。均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原 成份.有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測定（如血清,尿液）,有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）.大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本 .血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等于血清.制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑,而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固,血塊收縮后即可取得.除特殊情況外,在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測標(biāo)本.在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用.血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集,應(yīng)注意避免溶血,紅細(xì)胞溶解時(shí)會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中,溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色.血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測.如有細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng).如在冰箱中保存過久,其中的可發(fā)生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深.一般說來,在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃,超過一周測定的需低溫冰存.凍結(jié)血清融解后,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,應(yīng)充分混勻宜輕緩,避免氣泡,可上下顛倒混和,不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩.混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾,澄清后再檢測.反復(fù)凍融會使抗體效價(jià)跌落,所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存.保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無菌操作,也可加入適當(dāng)防腐劑.

    2 試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑. ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的.自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測量較正.從冰箱中取出的試 驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用.試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存.

    3 加樣

在 ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標(biāo)本,加酶結(jié)合物,加底物.加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部 ,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡.