摘要：ND4和ND5是線粒體基因組中編碼NADH脫氫酶亞基4和亞基5的兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。本研究以鰍超科魚(yú)類為研究對(duì)象，新測(cè)定了10個(gè)物種的ND4和ND5基因全序列，結(jié)合從GenBank下載的15個(gè)物種的15條序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：鰍超科魚(yú)類ND4基因全長(zhǎng)1380～1387bp，以ATG為起始密碼子，終止密碼子為不*終止信號(hào)；ND5基因全長(zhǎng)1821～1839bp，同樣起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA或TAG；ND4和ND5基因之間插入了3個(gè)tRNA基因，分別編碼攜帶*、*、*的tRNA。ND4和ND5基因（包含3個(gè)tRNA基因）中A、T、G、C的平均含量分別為30.4%、27.3%、14.2%、28.1%，A+T （57.7%） 的含量高于G+C （42.3%） 的含量。轉(zhuǎn)換與顛換比（Ts/Tv）平均值為1.586。選取斑馬魚(yú)和鯉魚(yú)作為外類群，采用zui大簡(jiǎn)約法（MP）、zui大似然法（ML）和貝葉斯推斷法（BI）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的重建。三種方法的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果都顯示：花鰍亞科、條鰍亞科、沙鰍亞科、平鰭鰍科及Vaillanlidae分別構(gòu)成單系；它們的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系為：（（（（條鰍亞科+平鰭鰍科）+花鰍亞科）+沙鰍亞科）+Vaillanlidae）。這與線粒體全基因組和某些核基因（如RAG1基因）的研究結(jié)果類似，且支持率較高，表明ND4和ND5基因用于鰍超科魚(yú)類的系統(tǒng)發(fā)育分析是可行的。但是本研究的結(jié)果有別于其它線粒體基因的分析結(jié)果，如基于cyt b和Dloop基因進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析認(rèn)為條鰍亞科和花鰍亞科聚為姐妹群，再和平鰭鰍科聚在一起。這種差異可能是由于線粒體基因的信息量差異造成的，信息量越大，所反映的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果可能更加接近真實(shí)情況。

 

關(guān)鍵詞：鰍超科 ND4ND5基因 序列分析 系統(tǒng)發(fā)育

 

鰍超科（Cobitoidea）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）。鯉形目是世界上zui大的淡水魚(yú)類類群，約有3268種（Nelson,2006），在經(jīng)濟(jì)發(fā)展和科學(xué)研究中占有很重要的地位。傳統(tǒng)的鯉形目魚(yú)類研究多以形態(tài)特征為基礎(chǔ)，其分類及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還存在較多爭(zhēng)議，為此，美國(guó)自然科學(xué)基金資助了 “鯉形目生命樹(shù)（Cypriniformes Tree of Life, CToL）”的合作項(xiàng)目，希望聯(lián)合世界各國(guó)的魚(yú)類學(xué)研究者通過(guò)綜合魚(yú)類化石、形態(tài)特征及分子等各個(gè)方面的數(shù)據(jù)資料對(duì)鯉形目魚(yú)類的系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題進(jìn)行全面的研究。

鰍超科是鯉形目中較為重要的一個(gè)類群，其物種數(shù)約占整個(gè)鯉形目的26％（Nelson,2006）。到目前為止，鰍超科的分類及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還未澄清。關(guān)于鰍超科的分類，Sawada（1982）根據(jù)48個(gè)種及亞種的52個(gè)骨骼及外部性狀特征，把鰍超科分為鰍科（Cobtidae）和平鰭鰍科（Balitoridae）兩個(gè)科，其中鰍科包括沙鰍亞科（Botiinae）和花鰍亞科（Cobitinae），平鰭鰍科科包括條鰍亞科（Nemacheilinae）和平鰭鰍亞科（Balitorinae）。而國(guó)內(nèi)學(xué)者則大多數(shù)將條鰍亞科歸為鰍科（陳景星，1995；及各地方魚(yú)類志等）。目前上廣為接受的是Sawada（1982）的觀點(diǎn)（Nelson, 2006；Saitoh等2006）。后來(lái)的研究者將以上四個(gè)亞科分別提升到科的水平，但在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上還存在爭(zhēng)議（Nalbant和Bianco,1998; Saitoh等2006；Tang等，2006；Šlechtová等2007）。

20世紀(jì)80年代后期以來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)在生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域中的迅猛發(fā)展，使分子數(shù)據(jù)更廣泛應(yīng)用于魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育研究并發(fā)揮著重要作用。DNA序列包含極為豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息，而且隨著PCR、DNA序列測(cè)定技術(shù)的發(fā)展使大量DNA序列的獲得趨于快捷、準(zhǔn)確，相應(yīng)構(gòu)樹(shù)方法的不斷改進(jìn)，也使得使用大量的分子性狀構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)成為現(xiàn)實(shí)。線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，是能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換的場(chǎng)所，還參與脂肪酸的合成及少量蛋白質(zhì)的合成。ND4和ND5是線粒體基因組中編碼NADH脫氫酶亞基4和亞基5的兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。ND4、ND5基因有相對(duì)較快的進(jìn)化速率，比較適合系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的重建（Zardoya和Meyer,1996）。

就同一研究類群而言，與短片段序列數(shù)據(jù)集相比，長(zhǎng)片段序列數(shù)據(jù)集具有更多的數(shù)據(jù)信息，能夠構(gòu)建出更可靠的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（參考文獻(xiàn)）。線粒體ND4、ND5基因及兩個(gè)基因間的3個(gè)tRNA基因的聯(lián)合序列（以ND4+5來(lái)表示）與應(yīng)用廣泛的cyt b基因相比，具有更多的核苷酸位點(diǎn)，信息量大很多。因此，本研究采用ND4+5基因序列為分子標(biāo)記，結(jié)合從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的其它15種鰍超科魚(yú)類的同源序列，以斑馬魚(yú)（Daniorerio）和鯉魚(yú)（Cyprinuscarpio）作外類群，重建鰍超科魚(yú)類的分子系統(tǒng)樹(shù)。

 

1.1 研究用標(biāo)本 DNA測(cè)序分析采用的樣品均為95%的酒精固定標(biāo)本，主要從國(guó)內(nèi)各水系收集獲得，標(biāo)本保存于*水生生物研究所淡水魚(yú)類博物館。具體種類及其它詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

 

1.2 基因組DNA的提取 在本研究中，采用了兩種提取DNA的方法，一種為常規(guī)的酚-氯仿抽提法，另一種為高鹽抽提法。方法如下。

酚-氯仿抽提法，取魚(yú)背部肌肉適量于1.5mL的Eppendorf管中，用蒸餾水、TE（10mmol/L Tris.HCl，1mmol/L EDTA，pH=8.0）緩沖液浸泡，直到組織中無(wú)酒精味。然后加入620μL的SET（0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris.HCl，1mmol/L EDTA，pH=8.0）細(xì)胞裂解液，70μL10%的SDS，10μL蛋白酶K（10μg/μL），置于55℃的恒溫箱中消化至透明。加入等體積的平衡酚抽提兩次，再加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）抽提，至無(wú)蛋白質(zhì)。加入上清液兩倍體積的無(wú)水乙醇沉淀2h以上，離心后再用75%的乙醇洗滌沉淀，再離心去乙醇干燥后加入30-50μL的滅菌雙蒸水或TE緩沖液溶解，并存于-20℃的冰箱中備用。

高鹽抽提法，取魚(yú)背部肌肉適量于2mL的Eppendorf管中，剪碎烘干，加入500μL HOM Buffer和10～15μL蛋白酶K，置于55℃的恒溫箱中消化至透明。加入500μL NaCl（4.5mol），300μL氯仿離心。加入600μL異丙醇沉淀，于-20℃保存1h以上，離心后再用70%乙醇洗滌，干燥后加入50μL滅菌雙蒸水溶解，同樣存于-20℃的冰箱中備用。

 

1.3 PCR擴(kuò)增 ND4+5基因序列全長(zhǎng)3387～3443bp。在mtDNA上，ND4基因左側(cè)是ND4L基因，ND5基因右側(cè)是ND6基因，ND4和ND5基因之間是3個(gè)tRNA基因。基于此結(jié)構(gòu)，分別在ND4L、ND6基因的側(cè)翼區(qū)及ND4、ND5基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物。用于擴(kuò)增的引物共5對(duì)：LArgd1+H11618d；L11427dA+H12632dB；L12328d+H13393d；L13058d+H13721d；L13559d+H14710d。

PCR反應(yīng)的總體積為60μL，反應(yīng)體系包括：10×Buffer 6μL，dNTPs 1.2μL（每個(gè)堿基濃度為2.5mmol/L），引物各1.5μL（10pM），Taq酶3.0U。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，然后循環(huán)包括：94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，zui后再72℃延伸5min。

 

1.4 PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序 PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，并在紫外投射儀上觀察。PCR產(chǎn)物用試劑盒進(jìn)行割膠回收或直接過(guò)柱回收?；厥债a(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序。

 

1.5 數(shù)據(jù)分析 DNA序列的排列使用ClustalX軟件，并進(jìn)行手工調(diào)整。從GenBank下載鰍超科魚(yú)類和外類群魚(yú)類的ND4＋5基因序列。通過(guò)比對(duì)分析找出序列的起始密碼子（ATG）和終止密碼子，刪除起始密碼子前和終止密碼子后的堿基。序列中各堿基的含量及變異情況用Mega4.0中的Statistic命令進(jìn)行分析。用PAUP^*軟件統(tǒng)計(jì)出序列中轉(zhuǎn)換和顛換的數(shù)目以及序列的變異情況（用GTR模型下的遺傳距離，GTR distances），并在Statistica 6.0軟件中進(jìn)行作圖分析序列中堿基替代的飽和程度。分子系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建采用zui大簡(jiǎn)約法（MP）、zui大似然法（ML）和貝葉斯推斷法（BI），其中MP和ML法采用為PAUP^*4.0b10（Swofford,2002）軟件，BI法采用MrBayesV3.0（Ronquist和Huelsenbeck,2003）軟件。

 

2.1 鰍超科魚(yú)類ND4＋5基因序列與遺傳變異分析 鰍超科魚(yú)類ND4基因全長(zhǎng)1380～1387bp，以ATG為起始密碼子，終止密碼子為不*終止信號(hào)；ND5基因全長(zhǎng)1821～1839bp，同樣起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA或TAG；ND4和ND5基因之間插入了3個(gè)tRNA基因，分別編碼攜帶*、*、*的tRNA，序列長(zhǎng)度分別為70bp、68bp、73bp。ND4＋5基因中A、T、G、C的平均含量分別為30.4%、27.3%、14.2%、28.1%，A+T （57.7%） 的含量高于G+C （42.3%） 的含量。

基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離，以確定類群間的遺傳分化程度，結(jié)果顯示類群間的遺傳距離值為0.203～0.255（表2）。鰍超科ND4＋5基因序列轉(zhuǎn)換與顛換之比（Ts/Tv）的變異范圍為0.983～9.579，平均值為1.586。在供分析的3462個(gè)位點(diǎn)中，共有1899個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)為1525個(gè)。圖1顯示所有個(gè)體ND4+5基因序列的轉(zhuǎn)換和顛換均未達(dá)到飽和，說(shuō)明序列中的替代均具有系統(tǒng)發(fā)育意義，可用于數(shù)據(jù)分析。在所有的變異水平上，轉(zhuǎn)換數(shù)明顯大于顛換數(shù)。

 

2.2 分子系統(tǒng)樹(shù) 基于目前的數(shù)據(jù)，我們分析了鰍超科魚(yú)類五個(gè)不同的類群，條鰍亞科，花鰍亞科，沙鰍亞科，平鰭鰍科和Vaillanlidae。其中Vaillanlidae只包含一個(gè)屬Vaillanla，該屬只分布于印尼及馬來(lái)西亞一帶（fishbase）。使用zui大簡(jiǎn)約法（MP）、zui大似然法（ML）和貝葉斯推斷法（BI）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)。三種方法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致（圖2－4）。

以斑馬魚(yú)（Danio rerio）和鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）作外類群，三種構(gòu)樹(shù)方法的結(jié)果一致顯示，鰍超科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系為：（（（條鰍亞科+平鰭鰍科）+花鰍亞科）+沙鰍亞科）+Vaillanlidae）；條鰍亞科、平鰭鰍科、花鰍亞科、沙鰍亞科和Vaillanlidae這五個(gè)類群都各自獨(dú)立形成單系，且都得到較高的支持率（均超過(guò)90；見(jiàn)圖2-4）；條鰍亞科和爬鰍科的魚(yú)類聚在一起構(gòu)成一個(gè)分支（lineage），均得到較高的支持（MP樹(shù)中為自展支持率（bootstrap value, BP）為50，ML樹(shù)中BP為68， BI樹(shù)中后驗(yàn)概率（posterior probability，PP）為94）。該分支與花鰍亞科構(gòu)成姐妹群，然后再與沙鰍亞科一起構(gòu)成一個(gè)大的分支群。Vaillanla處于所有鰍類的根部位置，成為一個(gè)獨(dú)立的分支，其支持率較高（MP樹(shù)中為78，ML樹(shù)中為76，BI樹(shù)中為100）。至于每個(gè)類群內(nèi)部物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，MP樹(shù)（圖2）、ML樹(shù)（圖3）和BI樹(shù)（圖4）的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)幾乎一致，只在部分樣本（花鰍亞科中花鰍屬的三個(gè)物種及條鰍亞科中的四個(gè)物種）的分支順序存在差異。

平鰭鰍科明顯分為兩個(gè)支系：平鰭鰍亞科和腹吸鰍亞科，它們分別構(gòu)成單系群。腹吸鰍亞科的支持率在三種方法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中都為100%，平鰭鰍亞科的支持率分別為82%（MP樹(shù)）、68%（ML樹(shù)）和98%（BI樹(shù)）。花鰍亞科中，花鰍屬（Cobitis）和泥鰍屬（Misgurnus）的物種都能分別構(gòu)成單系,且支持率很高（見(jiàn)圖2-4）。由圖可知，ML樹(shù)和BI樹(shù)中花鰍屬的聚類情況跟MP樹(shù)中花鰍屬的聚類情況有所不同。本研究的樣本包含沙鰍亞科中的兩個(gè)屬：沙鰍屬（Botia）和薄鰍屬（Leptobotia）（陳景星，1980；Nelson，1994；唐瓊英等，2008），在三種樹(shù)中各自構(gòu)成單系。

 

3.1 ND4和ND5基因的特點(diǎn)及在系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用 mtDNA不同區(qū)段基因序列的進(jìn)化速度不一樣（李耀東和邵嘉會(huì)，2006）。因此，選取mtDNA上的不同基因或片段序列，可以進(jìn)行不同分類水平上的進(jìn)化研究。對(duì)于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種，一般選取選擇壓力大、比較保守的基因序列；對(duì)于親緣關(guān)系較近的物種，則選取選擇壓力小、進(jìn)化較快的基因序列。

    Cyt b基因的序列長(zhǎng)度在各科之間的差異很大，但科內(nèi)之間的序列長(zhǎng)度是一致的，因此cyt b序列是可用來(lái)研究科內(nèi)屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（Akihito等，2000；Reed和Carpenter，2002）。NADH作為線粒體呼吸鏈上的一種功能蛋白，它的基因序列一般很少被用來(lái)研究系統(tǒng)發(fā)育。從本研究的結(jié)果來(lái)看，在進(jìn)行同一個(gè)目?jī)?nèi)科水平親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種群系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，ND4和ND5基因也不乏一個(gè)好的研究序列。

也有研究結(jié)果表明，在高階元類群的分子系統(tǒng)發(fā)育研究中不要使用cyt b和12S/16S rRNA基因作為分子標(biāo)記（Meyer，1994；Ortí和Meyer，1997；Farias等，2001），但這些基因仍然作為許多魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育的“標(biāo)準(zhǔn)”分子標(biāo)記而被廣泛使用。由于cyt b和12S/16S rRNA基因容易擴(kuò)增，所以它們被測(cè)序的頻率與其它線粒體基因相比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出4倍多（Miya等，2006）。除此之外，這些基因在系統(tǒng)發(fā)育分析上的表現(xiàn)并不比其它線粒體基因表現(xiàn)出更多的*性（Miya和Nishida，2000）。

另外，在重建高水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上，序列長(zhǎng)度逐漸成為一個(gè)評(píng)價(jià)基因特征的重要方面?？紤]到類群樣本數(shù)量的限制，序列約3kb是一個(gè)較為理想的長(zhǎng)度（Miya等，2006）。ND4+5基因全長(zhǎng)3387～3443bp，與cyt b基因（1140bp）相比，包含更多的系統(tǒng)發(fā)育信息，將該標(biāo)記用于分子系統(tǒng)發(fā)育分析，可能會(huì)得到更為準(zhǔn)確的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

就ND4和ND5基因而言，這兩個(gè)基因單獨(dú)用于系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究已有很多。張四明等（1999）分析12種鱘形目魚(yú)類的ND4基因的序列變異，確定了部分鱘魚(yú)的親緣關(guān)系。Mou等（2005）以ND4L和ND4基因?yàn)闃?biāo)記研究了黑腹果蠅的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。張祖興等（2006）對(duì)ND5基因進(jìn)行克隆和序列分析，進(jìn)一步確定了大黃魚(yú)的分類地位。Makita等（2000）將ND5應(yīng)用于虎鳳蝶屬（ Luehdorfia）的種間研究，結(jié)果顯示，Luehdorfia 屬的種和外群蝴蝶種間ND5基因差異較大，同屬內(nèi)不同物種間ND5基因的差異相對(duì)要小。

本研究將ND4和ND5基因聯(lián)合起來(lái)，對(duì)鰍超科魚(yú)類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，重新將各類群之間的關(guān)系整理了一遍。

 

3.2 鰍超科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 鰍超科中關(guān)于鰍科和平鰭鰍科魚(yú)類劃分的問(wèn)題，一致存在爭(zhēng)議。Sawada（1982）和Siebert（1987）基于外部形態(tài)和骨骼特征的分析結(jié)果認(rèn)為，鰍科只含兩個(gè)亞科：花鰍亞科和沙鰍亞科，他們認(rèn)為條鰍亞科與平鰍鰍科的成員有較近的親緣關(guān)系，條鰍亞科應(yīng)歸為平鰭鰍科的成員。后來(lái)的研究認(rèn)為條鰍亞科和平鰭鰍科的成員在形態(tài)上及分子上均存在較大的差異（朱松泉，1995；Nablbant和Bianco，1998；Tang，2006）。Nalbant和Bianco（1998）認(rèn)為Sawada（1982）研究中所用的骨骼性狀，在條鰍亞科和平鰭鰍科中較為相似是因?yàn)槎呲呁M(jìn)化形成的，因此Nalbant和Bianco（1998）將條鰍亞科作為一個(gè)獨(dú)立的科對(duì)待。Tang（2006）基于線粒體cyt b和Dloop基因的分析結(jié)果認(rèn)為，條鰍亞科和花鰍亞科構(gòu)成姐妹群，再和平鰭鰍科聚在一起。

本研究立足于分子水平，以ND4+5基因作為分子標(biāo)記所得出的結(jié)果與核基因（Šlechtová等，2007）及線粒體全基因組（Saitoh等，2006）作為分子標(biāo)記所得出的結(jié)果一致，即條鰍亞科和平鰭鰍科構(gòu)成姐妹群，再和花鰍亞科聚在一起。說(shuō)明條鰍亞科魚(yú)類與平鰭鰍科魚(yú)類的有更近的親緣關(guān)系。

這種結(jié)果的差異可能是由于基因的信息量差異造成的，信息量越大，所反映的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果可能更加接近真實(shí)情況。因此，當(dāng)樣本質(zhì)量不好導(dǎo)致某些核基因很難擴(kuò)增出來(lái)的時(shí)候，ND4+5基因可以作為一個(gè)很好的分子標(biāo)記進(jìn)行分析。

本研究中，Vaillanla處于所有鰍類的根部位置，成為一個(gè)獨(dú)立的分支，其支持率較高（MP樹(shù)中為78，ML樹(shù)中為76，BI樹(shù)中為100）。曾有研究對(duì)Vaillanla的系統(tǒng)發(fā)育位置持不同的觀點(diǎn)。Sawada（1982）和Siebert（1987）基于形態(tài)數(shù)據(jù)分析研究顯示，Vaillanla被分別歸為兩個(gè)不同科的物種。有人提出將這個(gè)屬劃分到一個(gè)獨(dú)立的科Vaillanlidae（Nalbant和Bǎnǎrescu，1977；Šlechtová等，2007）。我們的研究支持這個(gè)觀點(diǎn)。

分子系統(tǒng)樹(shù)顯示：條鰍亞科中兩個(gè)南鰍屬（Schistura）的物種沒(méi)有聚類在一起。在MP樹(shù)中，橫紋南鰍（Schistura.fasciolata）與平頭平鰍（Oreonectes.platycephalus）聚在一起。而在MP樹(shù)和BI樹(shù)中，橫紋南鰍（Schistura.fasciolata）與Barbatula.toni聚在一起。由此推斷，南鰍屬可能不是一個(gè)單系。

 

 

 

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