如果有人告訴你用顯微鏡實(shí)時觀測單分子DNA聚合酶復(fù)制DNA，并用它來測序，你一定會認(rèn)為他異想天開，沒有一點(diǎn)生物的sense。

我zui初就是這樣認(rèn)為的，然而它不僅可以實(shí)現(xiàn)，而且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了！這個就是被稱為第三代的測序技術(shù)，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time （SMRT™） DNA Sequencing”（單分子實(shí)時DNA測序）。

我有幸在NIH聽到了這個技術(shù)發(fā)明人Stephen Turner博士的講座，根據(jù)自己粗淺的理解記錄整理一下。

要實(shí)現(xiàn)單分子實(shí)時測序，有三個關(guān)鍵的技術(shù)。

*個是熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸。顯微鏡現(xiàn)在再厲害，也不可能真的實(shí)時看到“單分子”。但是它可以實(shí)時記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入 DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在DNA鏈上探測到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時候，它的熒光基團(tuán)就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈*一樣。

第二個是納米微孔。因?yàn)樵陲@微鏡實(shí)時記錄DNA鏈上的熒光的時候，DNA鏈周圍的眾多的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。這種強(qiáng)大的熒光背景使單分子的熒光探測成為不可能。Pacific Biosciences公司發(fā)明了一種直徑只有幾十納米的納米孔[zero-mode waveguides （ZMWs）]，單分子的DNA聚合酶被固定在這個孔內(nèi)。在這么小的孔內(nèi)，DNA鏈周圍的熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G這四種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M(jìn)入到孔內(nèi)又出去，它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號。而當(dāng)某一種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時，這種特定顏色的熒光會持續(xù)一小段時間，直到新的化學(xué)鍵形成，熒光基團(tuán)被DNA聚合酶切除為止（見圖）。
 

第三個是共聚焦顯微鏡實(shí)時地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時進(jìn)行記錄。由于我對顯微原理的物理知識匱乏，而Pacific Biosciences公司又沒有非常強(qiáng)調(diào)在這方面的發(fā)明，不做進(jìn)一步探討。

他們還對這一技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

*個是把雙鏈DNA環(huán)化反復(fù)測序。人們可以在雙鏈DNA的兩頭連上發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA adaptor，從而使DNA環(huán)化。而DNA聚合酶就能夠以環(huán)化的DNA作為模板滾環(huán)復(fù)制，反復(fù)測一段DNA序列。這種反復(fù)測序，糾正了偶爾出現(xiàn)的復(fù)制錯誤，從而使測序精度非常高。

第二個是激發(fā)光中斷測序法。DNA聚合酶雖然很穩(wěn)定，但是在強(qiáng)大的激發(fā)光作用下酶也是有一定壽命的。如果把激發(fā)光中斷一段時間，在這段時間內(nèi)DNA聚合酶繼續(xù)復(fù)制DNA，當(dāng)激發(fā)光重新開啟以后，人們就可以測到長DNA鏈后面的序列。

第三代測序技術(shù)非常可怕。1、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍。2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應(yīng)就可以測非常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。3、它的精度非常高，達(dá)到 99.9999%。

此外，它還有兩個應(yīng)用是二代測序所不具備的。

*個是直接測RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠?qū)崟r觀測，那么以RNA為模板復(fù)制DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶也同樣可以。RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。

第二個是直接測甲基化的DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時間不同。根據(jù)這個不同的時間，可以判斷模板的C是否甲基化。

Pacific Biosciences公司預(yù)計2010年或者2011年就會推出商業(yè)化的測序儀器。在不遠(yuǎn)的將來，如果他們能和二代測序一樣集成100萬個納米微孔，那么一臺儀器15分鐘就能夠準(zhǔn)確地測出一個人的基因組。以后每個人的基因組測序成本將變成100美元，人人都可以消費(fèi)得起。想想人類基因組計劃耗資30億美元，費(fèi)時十幾年，無數(shù)科學(xué)家參與其中，技術(shù)的革新意義是多么重大??！

介紹完三代測序技術(shù)之后，請允許我販賣點(diǎn)私貨：

1、創(chuàng)新創(chuàng)新再創(chuàng)新。國內(nèi)多數(shù)導(dǎo)師為了掩飾自己idea的匱乏，極力壓制學(xué)生的冒險欲望，鼓勵學(xué)生對一個小的問題花無數(shù)的時間用data堆成文章。其實(shí)想做真正有挑戰(zhàn)性的課題的想法是非?？少F的，導(dǎo)師一個很重要的功能是幫助學(xué)生評估他們想法的可行性，在可行的情況下盡量提供條件讓他們自己去闖。從想做真正科研的學(xué)生的角度來說，讓那些不能激動你的保險課題見鬼去吧，花大力氣去尋找一些真正能貢獻(xiàn)科學(xué)，貢獻(xiàn)社會的課題，不要害怕一時的挫折，這是科研的真意！

2、不要鄙視公司。有很多人以為學(xué)院派的科研是的，其實(shí)真正推動科學(xué)進(jìn)步的絕不僅僅是發(fā)生在學(xué)校和研究所的科研。公司同樣能做非常令人暈眩的研究，經(jīng)濟(jì)意義，社會效益有時候恐怕遠(yuǎn)甚于學(xué)院派研究。美國的許多應(yīng)用研究就是在公司里面完成的。

3、學(xué)科交叉。緊咬你的可貴想法，然后橫跨各個學(xué)科，自己學(xué)或者尋合作者。光是生物背景，想要發(fā)明第三代測序技術(shù)，那就是個笑話。