200．蘇州華宇凈化工作臺(tái)在柑橘類果汁中檸檬苦素的含量及其性質(zhì)研究中的應(yīng)用實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)

1 材料與方法          

1.1 主要儀器與材料

SW-CJ-IF 凈化工作臺(tái)：蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；高壓滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器有限公司；JA1003N 分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Model680 全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀：BIO-RAD 公司；CO2 培養(yǎng)箱：SANYO 公司；SW-CJ-IF 凈化工作臺(tái)：蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：海門市天龍實(shí)驗(yàn)器。檸檬苦素：由本實(shí)驗(yàn)室按照文獻(xiàn)[3]制備；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）As1.140：購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；細(xì)胞株：人胃癌細(xì)胞SGC7901，購(gòu)于上海細(xì)胞生物研究所；二甲亞砜：購(gòu)于AMRESCO 公司。噻唑藍(lán)（MTT）：AMRESCO0793 產(chǎn)品；RPMI1640 培養(yǎng)液：Hyclone 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果汁中檸檬苦素含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

1.2.2 檸檬苦素的抗氧化活性

采用豬油自由基體系中豬油過(guò)氧化值（POV）表示。在新鮮豬油中按不同添加量添加檸檬苦素（0.1、0.2、0.4、0.8 g/kg）及BHT（0.2 g/kg）,置于70 ℃恒溫烘箱中，測(cè)定豬油過(guò)氧化值（POV）的變化情況[4]。

1.2.3 檸檬苦素的抑菌活性

牛津杯瓊脂擴(kuò)散法，參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行。取處于不同生長(zhǎng)時(shí)期的枯草芽孢桿菌涂布平板，放置牛津杯，培養(yǎng)24 h 后測(cè)量抑菌圈直徑大小。檸檬苦素濃度為0.5 g/L，以溶解檸檬苦素的二氯甲烷溶液為空白對(duì)照。

1.2.4 檸檬苦素的抗腫瘤活性

通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)（MTT 法）測(cè)定。

檸檬苦素溶液的制備：檸檬苦素溶解于二甲亞砜（DMSO）中，配成10 g/L 儲(chǔ)存于0 ℃?zhèn)溆?。臨用前用培養(yǎng)液配成100 mg/L，4 倍遞減稀釋。細(xì)胞株培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞SGC7901 接種在含10 %胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中，置于CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃，5 % CO2 及飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的測(cè)定：選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25 %的胰蛋白酶消化，0.01 mol/L PBS pH7.4 洗2 次，以108 個(gè)/L~1011 個(gè)/L 的濃度接種于96 孔板中，每孔150 μL。培養(yǎng)24 h 后試驗(yàn)組依次加入新配制的含不同濃度檸檬苦素的培養(yǎng)基20 μL，終濃度為4、20、100 g/L，每個(gè)濃度3 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)用含DMSO 的*培養(yǎng)基作對(duì)照。每天取一培養(yǎng)板加入20 μL MTT（終濃度0.25 g/L），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μLDMSO，振蕩器振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570 nm 波長(zhǎng)在自動(dòng)酶標(biāo)分析儀上測(cè)各孔的光吸收值。存活率/%=（試驗(yàn)組測(cè)定的平均A 值/對(duì)照組測(cè)定的平均A 值）×100