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閱讀:189發(fā)布時間:2018-2-26
聚丙烯酰胺凝膠電泳(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,簡稱PAGE),用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。
聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有分子篩效應(yīng)。SDS-PAGE根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同,可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)zui初由shapiro于1967年建立,在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑(SDS即十二烷基硫酸鈉)后,蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀?/span>
SDS-PAGE是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成,聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種:化學(xué)聚合法和光聚合法?;瘜W(xué)聚合以過硫酸銨(APS)為催化劑,以四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。在聚合過程中,TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基,后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合,同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián),從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng),分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類,連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同,帶電顆粒在電場作用下,主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分,pH,凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性,帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng),分子篩效應(yīng),還具有濃縮效應(yīng),因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠,凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HCl。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠,凝膠緩沖液為pH8.9 Tris-HCl。電極緩沖液是pH8.3 Tris-*緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性,這是樣品濃縮的主要因素。
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