一、測(cè)定原理：

谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT) 在 37℃及 PH7.4 條件下，作用于及α-酮戊二酸組成的底物，生成丙酮酸及。反應(yīng) 30min 后 (固定時(shí)間) 加入 肼 (DNPH) 鹽酸溶 液，既中止反應(yīng)， 同時(shí) DNPH 與酮酸中羰基加成，生成丙酮 酸苯腙。苯腙在堿性條件下呈紅棕色，于 505nm 比讀吸光度 并計(jì)算酶活力。

二、試劑的組成與配制：(96T)

試劑一:谷丙轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液,5mL×1 瓶，4℃冰箱保存 6 個(gè)月； 試劑二肼液,5mL×1 瓶，4℃冰箱保存 6 個(gè)月； 試劑三:4mol/L 氫氧化鈉液,5mL×1 瓶，室溫密封保存 6 個(gè)月； 0.4mol/L 氫氧化鈉液的配制, 臨用時(shí)按 4mol/L 氫氧化鈉液:雙

蒸水=1 ∶9 的比例稀釋?zhuān)瓒嗌倥涠嗌?，室溫密封保存?/span> 試劑四:2mol/mL 丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液×1 支，4℃冰箱保存 6 個(gè)月； 試劑五:0. 1mol/L 磷酸鹽緩沖液×1 支，4℃冰箱保存 6 個(gè)月。

三、操作過(guò)程：

1 、樣本前處理:

①、血清 (漿) 及其它液體樣本待測(cè)：直接測(cè)定。

② 、動(dòng)物組織樣本：準(zhǔn)確稱(chēng)取組織重量，按重量 (g) ：體積 (mL)=1:9 的比例，加入 9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件 下機(jī)械勻漿，2500 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，取上清液待測(cè)。

③ 、培養(yǎng)細(xì)胞樣本前處理：將收集好的細(xì)胞用等滲緩沖液 (推 薦 0.1mol/L pH7~7.4 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水) 清洗 1~

2 次；1000 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,棄上清, 留細(xì)胞沉淀，加入勻 漿介質(zhì) (推薦加入 0.1mol/L    pH7~7.4 磷酸鹽緩沖液或生 理鹽水) ，冰水浴條件

1 、比色法中常用的有賴(lài)氏 (Reitman-Frankel) 法及金氏 (King) 法。賴(lài)氏法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所定單位數(shù)，是用實(shí)驗(yàn)方法和卡門(mén)氏分 光  光度法 (速率法) 作對(duì)比測(cè)定求得的。 以卡門(mén)氏單位報(bào) 告結(jié)果，比較準(zhǔn)確。

卡門(mén)氏單位定義：1mL 液體，反應(yīng)液總?cè)萘?/span> 3mL ，波長(zhǎng) 340nm， 1cm 光徑，25℃ ，1min 內(nèi)所生成的丙酮酸，使 NADH 氧化 成 NAD+而引起吸光度每下降 0.001 為一個(gè)單位 ( 1 卡門(mén)氏 單位=0.482 U/L ，25℃) 。

2 、一般血清標(biāo)本內(nèi)源性酮酸很少，血清對(duì)照孔吸光度值接近試 劑空白孔 (以雙蒸水代替血清，其他和對(duì)照孔同樣操作) 。 所以，成批標(biāo)本測(cè)定時(shí)，一般不需要每一標(biāo)本都作本身血清 對(duì)照孔， 以試劑空白孔代替即可，但對(duì)脂血、黃疸或溶血血 清，每份標(biāo)本應(yīng)作對(duì)照孔。

3 、酶活力超過(guò) 150 卡門(mén)氏單位時(shí)，用生理鹽水稀釋血清后重測(cè)。

4 、應(yīng)將一般血清的對(duì)照孔 (或稱(chēng)標(biāo)本空白孔) 的吸光度作為日 常質(zhì)控的指標(biāo)之一；如相差大，可考慮α-酮戊二酸濃度、DNPH 濃度及儀器等原因引起。

5 、血清中ALT 在室溫 (25℃) 可保存 2 天，在 0~4℃可保存一 周，在-25℃可保存 1 個(gè)月。