超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書

主要用途

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase；SOD）活性檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)比色測(cè)定高度可溶性的四唑鹽在超氧化物陰離子的還原作用下產(chǎn)生的水溶性甲臢染料，來(lái)定量分析氧化酶的還原效率，由此檢測(cè)超氧化物岐化酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞和組織，包括紅細(xì)胞或線粒體中超氧化物歧化酶的活性檢測(cè)以及50%活性抑制率（IC50）。廣泛運(yùn)用于醫(yī)藥研究、生化分析、植物生理、食品工程等方面。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

超氧化物岐化酶（SOD），是體內(nèi)的重要金屬酶抗氧化劑，催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過(guò)氧化氫（H2O2）和分子氧（O2），破壞自由基，防止氧毒性。SOD濃度的變化與許多疾病密切相關(guān)。檢測(cè)超氧化物岐化酶活性的方法包括氮藍(lán)四唑（nitroblue tetrazolium；NBT）法，使用和氧化酶來(lái)控制超氧化物的生成并檢測(cè)超氧自由基的NBT的比率，其敏感度較高。但是NBT的還原終產(chǎn)物雙甲臢染料水溶性差，易和還原的氧化酶相互作用。還原法通過(guò)還原后的生成紫色的染料，來(lái)檢測(cè)超氧自由基。但是還原后的的吸收峰過(guò)窄而敏感性差，并且受到與反應(yīng)的細(xì)胞提取物，例如NADPH還原酶或其他的還原劑干擾，造成背景噪音高，而無(wú)法測(cè)定低水平的SOD活性。 

超氧化物歧化酶活性檢測(cè)試劑使用高度水溶性的四唑鹽:WST-1[（2-（4-Iodophenyl）-3- （4-nitrophenyl）-5-（2,4-disulfophenyl）-2H-tetrazolium，monosodium salt）；2-(4–碘苯基)-3-（4–硝基苯基）-5-（2,4-苯二磺酸）-2H-四唑單鈉鹽]。WST-1靈敏度高，氧化態(tài)的吸光度低，呈淺黃色，水溶性好，可以100%被SOD抑制，檢測(cè)不受pH影響，背景噪音低。WST-1被O2^－還原（呈現(xiàn)深黃色）的還原率和氧化酶的活性成線性關(guān)系，該反應(yīng)能被超氧化物岐化酶（SOD）抑制（抑制，WST-1呈現(xiàn)無(wú)色）。利用SOD能抑制WST-1和O2^－的氧化還原能力來(lái)測(cè)定SOD的活性（波長(zhǎng)為450nm的比色分析）。

產(chǎn)品內(nèi)容

反應(yīng)液（Reagent A）               15毫升

染色液（Reagent B）                    75微升

催化液（Reagent C）                    40微升

稀釋液（Reagent D）                     2毫升

補(bǔ)充液（Reagent E）                1.5毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）                100微升

產(chǎn)品說(shuō)明書                  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent B），避免光照，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液配制的容器

15毫升錐形離心管：用于反應(yīng)液配制的容器

酶標(biāo)板或比色皿：用于比色分析的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化，然后移出4毫升反應(yīng)液（Reagent A）到新的15毫升錐形離心管，加入20微升染色液（Reagent B），輕柔混勻后，置于暗室里，標(biāo)記為染色工作液。然后移出400微升稀釋液（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，加入10微升催化液（Reagent C），輕柔混勻后，置于冰槽里，標(biāo)記為催化工作液。然后進(jìn)行下列操作。

一、 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備

1. 取出待測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F），置于冰槽里

2. 準(zhǔn)備1個(gè)96孔酶標(biāo)板，做好1至5號(hào)標(biāo)記，置于冰槽里

3. 按下列順序依次加入下列反應(yīng)液到96孔板的標(biāo)記孔里：

1） 分別移取20微升稀釋液（Reagent D）到96孔板的2至5號(hào)孔里

2） 移取40微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）到96孔板的1號(hào)孔里

3） 用200微升槍頭抽去20微升1號(hào)孔里的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）到96孔板的2號(hào)孔里

4） 用200微升槍頭上下抽吸混勻2號(hào)孔

5） 用200微升槍頭抽去20微升2號(hào)孔里含有標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）的稀釋液到96孔板的3號(hào)孔里

6） 用200微升槍頭上下抽吸混勻3號(hào)孔

7） 用200微升槍頭抽去20微升3號(hào)孔里含有標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）的稀釋液到96孔板的4號(hào)孔里

8） 用200微升槍頭抽去20微升4號(hào)孔里含有標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）的稀釋液，扔掉

9） SOD實(shí)際濃度見(jiàn)下表

二、 樣品測(cè)定

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)的樣品（例如細(xì)胞或組織勻漿上清液包括紅細(xì)胞以及胞漿SOD樣品或線粒體SOD樣品等）和上述制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品，置于冰槽里

2． 設(shè)定好酶標(biāo)儀并預(yù)熱：波長(zhǎng)450nm

3． 準(zhǔn)備好1個(gè)96孔板，做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品背景、零活性對(duì)照、活性對(duì)照、待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品

4． 按下表依次加入下列試劑到96孔板的相應(yīng)孔里：

A． 分別移取200微升含有反應(yīng)液（Reagent A）和染色液（Reagent B）的染色工作液到96孔板的所有孔里

B． 然后分別移取20微升含有催化液（Reagent C）和稀釋液（Reagent D）的催化工作液到96孔板的相應(yīng)孔里

C． 繼續(xù)分別移取20微升稀釋液（Reagent D） 到96孔板的相應(yīng)孔里

D． 繼續(xù)分別移取20微升補(bǔ)充液（Reagent E） 到96孔板的相應(yīng)孔里

E． 移取20微升待測(cè)樣品到96孔板的相應(yīng)孔里（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)6）

F． 最后分別移取上述制備的20微升不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）到96孔板的相應(yīng)孔里

5． 輕輕搖動(dòng)96孔板，混勻反應(yīng)液

6． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育20分鐘，避免光照

7． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)，波長(zhǎng)為450nm

8． 計(jì)算樣品SOD活性（SOD活性＝XO即氧化酶抑制百分率）：

1）[（活性讀數(shù)－零活性讀數(shù)）－（樣品活性讀數(shù)－樣本背景讀數(shù)）]÷（活性讀數(shù)－零活性

讀數(shù)）＝實(shí)際抑制百分率

2）IC50：50％抑制率所需的樣品SOD或樣品含有SOD蛋白濃度（毫克/毫升）

  X（所需樣品蛋白濃度）＝（已知樣品蛋白濃度÷實(shí)際抑制百分率）X 50％

3）樣品SOD實(shí)際活性單位計(jì)算：

A． 構(gòu)建SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線：橫座標(biāo)（x軸）為每毫升SOD單位濃度；縱坐標(biāo)（y軸）為標(biāo)準(zhǔn)樣品讀數(shù)（吸光單位OD值）

B． 根據(jù)SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)算樣品中含有SOD或SOD類物質(zhì)的活性單位（單位/毫克樣品）

C． 根據(jù)樣品50％抑制百分率，找到對(duì)應(yīng)SOD活性單位（單位/毫克樣品）

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為50次操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 操作時(shí)，須在4℃下進(jìn)行

4． 染色液（Reagent B）為淺黃色，如果有結(jié)晶析出，放進(jìn)37℃溫育數(shù)分鐘即可。染色液（Reagent B）一旦被還原，呈現(xiàn)可見(jiàn)黃色或深黃色；如果含有SOD，則會(huì)呈現(xiàn)為無(wú)色

5． 每增加10個(gè)樣品，增加染色工作液為：反應(yīng)液（Reagent B）2毫升＋染色液（Reagent B）10微升，和催化工作液為：稀釋液（Reagent D）200微升＋催化液（Reagent C）5微升，以此類推。配制工作液時(shí)，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實(shí)際工作液容量

6． 待測(cè)樣品總量通常為20至200微克的細(xì)胞裂解懸液或2至20微克線粒體裂解懸液

7． 測(cè)定20個(gè)以上樣品，建議使用排槍操作，以減少樣品操作時(shí)間上的延長(zhǎng)導(dǎo)致超氧化物（superoxide）的釋放而干擾精確測(cè)定

8． 孵育時(shí)，避免光照

9． 孵育后即刻比色測(cè)定

10． 建議每個(gè)樣品檢測(cè)重復(fù)3次

11． 0.1毫摩爾抗壞血酸（Ascorbic acid）、5毫摩爾還原型（Glutathione）和牛血清白蛋白會(huì)增加背景讀數(shù)，干擾樣品測(cè)定，但不影響實(shí)際活性檢測(cè)（已有背景讀數(shù)調(diào)整）

12． 樣品SOD實(shí)際活性單位定義：每毫克樣品蛋白含有X微克或X單位SOD量

13． 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）的活性單位定義為25℃溫度，pH7.8的條件下，抑制50%在氧化酶參與的反應(yīng)系統(tǒng)中，WST-1和O2^－之間的氧化還原能力

14． 本公司提供系列超氧化物歧化酶分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感