HL10103.6 v.A

細(xì)菌琥珀酸脫氫酶（SDH）活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)菌琥珀酸脫氫酶（SDH）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成電子受體染料，通過反應(yīng)系統(tǒng)測定染料還原后峰值的降低，即采用比色法測算樣品中單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細(xì)菌菌株裂解懸液和膜蛋白樣品琥珀酸脫氫酶的特異性活性檢測。用于衰老、能量代謝、蛋白組學(xué)、發(fā)酵分析等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

技術(shù)背景

琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase；SDH；EC 1.3.99.1）是三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle；TCA）或Krebs循環(huán)中與細(xì)胞線粒體膜相關(guān)的重要元素，位于線粒體內(nèi)膜，參與細(xì)胞呼吸鏈。細(xì)菌琥珀酸脫氫酶，又稱為SdhCDAB，為膜結(jié)合性蛋白，分為周邊（peripheral）和跨膜（transmembrane）部分，其中周邊親水部分由SdhA和SdhB亞體組成：SdhA亞體含有黃素蛋白（flavoprotein），是琥珀酸的活性部位；SdhB含有鐵硫蛋白（iron-sulfur protein），進(jìn)行電子傳遞；跨膜疏水部分由SdhC和SdhD亞體組成：SdhC含有亞鐵血紅素-B（Heme-B），SdhD含有泛醌（ubiquinone）結(jié)合部位（Q部位）。其作用在于參與三羧酸循環(huán)（TCA cycle）和呼吸鏈活動。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸（succinate）的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生延胡索酸（furmarate），通過黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）傳遞電子。基于琥珀酸脫氫酶的反應(yīng)原理，使用人工電子受體染料二氯靛酚鈉（2,6-Dichloroindophenol sodium；DCIP），接受來自還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（Reduced flavin Adenine Dinucleotide；FADH₂）的電子，而被還原，在分光光度儀下，其吸光值（600nm波長）的變化，來測算琥珀酸脫氫酶的活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

裂解液（Reagent A）    毫升

活性液（Reagent B）  微升

緩沖液（Reagent C）  毫升

反應(yīng)液（Reagent D）  毫升

底物液（Reagent E）    毫升

陰性液（Reagent F）  微升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；反應(yīng)液（Reagent D）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸；底物液（Reagent E），避免光照；有效保證3月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

超聲儀：用于裂解細(xì)菌細(xì)胞

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

比色皿：用于比色測定的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent E）注意避光。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好10毫升待測的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
• 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 加入xx微升活性液（Reagent B）
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 至于超聲儀下超聲處理：100功率，20秒超聲一次，冰上間隙1分鐘，重復(fù)3次
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品，置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長600nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：OD0分鐘－OD5分鐘 

• 樣品活性測定

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入100微升待測樣品（注意：10微克總膜蛋白或100微克細(xì)菌總蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數(shù)：OD0分鐘－OD5分鐘

• 計算樣品活性

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照測定
• 操作時，須戴手套
• 反應(yīng)液（Reagent D）含有毒性物質(zhì)，避免直接用手接觸
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 加入樣品后3秒內(nèi)即刻比色測定
• 比色測定初始讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)）0.8左右為理想狀態(tài)
• 反應(yīng)1分鐘后比色測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定持續(xù)5分鐘
• 測定值由高到低變化，即5分鐘測定讀數(shù)低于0分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本周膜蛋白濃度為10微克/100微升和細(xì)菌總蛋白濃度為100微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供細(xì)菌可溶性膜蛋白制備試劑盒30022.2 和 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 活性計算時，可以選擇5分鐘內(nèi)單位時間zui大線性變化的吸光值
• 琥珀酸脫氫酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1微摩爾氧化型二氯靛酚鈉（DCIP）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列琥珀酸脫氫酶技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準(zhǔn)確