HL10118.3 v.A

細(xì)胞/組織高質(zhì)純化溶酶體（lysosome）分離試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)胞/組織高質(zhì)純化溶酶體（lysosome）分離試劑是一種旨在從動物細(xì)胞或組織中分離出活性完整而高度純化的溶酶體細(xì)胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于動物軟組織（肝或腦組織）和培養(yǎng)細(xì)胞的溶酶體的制備。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度俱佳。

技術(shù)背景

溶酶體（lysosome）是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，含有酸性水解酶，例如酯酶、淀粉酶、蛋白酶、核酶等，分解各種細(xì)胞殘渣和廢棄物質(zhì)，包括過多的或破損的其它細(xì)胞器、食物顆粒、吞噬的細(xì)菌和病毒等。其大小為0.5至1.5微米，球圓形，溶酶體內(nèi)pH為5.0左右。溶酶體功能異常會引起溶酶體貯積癥（1ysosomal storage disorders；LSDs），例如家族性癡呆病（Tay-sachs disease）和龐貝氏癥 （Pompe’s disease）。溶酶體細(xì)胞器的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的zui常用的手段之一。從任何組織或細(xì)胞分離溶酶體的技術(shù)方法基本上采用：*，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細(xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得溶酶體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的溶酶體。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）   毫升

裂解液（Reagent B）   毫升

凈化液（Reagent C）   毫升

強(qiáng)化液（Reagent D）   毫升

分離液（Reagent E）   毫升

高純液A（Reagent F）   毫升

高純液B（Reagent G）   毫升

高純液C（Reagent H）   毫升

高純液D（Reagent I）   毫升

高純液E（Reagent J）   毫升

保存液（Reagent K）   毫升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（12028）或PBS緩沖溶液（12033）：用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃臺式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

4℃超速離心機(jī)：用于分離細(xì)胞器成分

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞

實驗步驟

• 動物軟組織溶酶體分離（組織勻漿法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移取xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時）
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預(yù)冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約60至80下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移取上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心移取5毫升上清液到新的15毫升離心管
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體粗提沉淀物
• 加入xx毫升分離液（Reagent E），混勻沉淀顆粒群
• 準(zhǔn)備1個6毫升超速離心管
• 移取xx毫升高純液A（Reagent F）到6毫升超速離心管底部（注意：使用前搖勻高純液A(Reagent F)）
• 輕輕加上xx毫升高純液B（Reagent G）在高純液A（Reagent F）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液B(Reagent G)）
• 輕輕加上xx毫升高純液C（Reagent H）在高純液B（Reagent G）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液C(Reagent H)）
• 輕輕加上xx毫升高純液D（Reagent I）在高純液C（Reagent H）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液D(Reagent I)）
• 輕輕加上xx毫升高純液E（Reagent J）在高純液D（Reagent I）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液E(Reagent J)）
• 輕輕加上xx毫升上述溶酶體混勻液在高純液E（Reagent J）的上面，避免震動
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心120分鐘，速度為145000g
• 小心收集頂部溶酶體樣品帶到15毫升錐形離心管——此步驟獲得高純溶酶體樣品
• 加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent K）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

二、動物軟組織溶酶體分離（化學(xué)處理法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移取xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定1克組織重量（實驗前使動物空腹12至24小時）
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放入液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入xx毫升預(yù)冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入xx微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）
• 加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent K），輕輕搖動試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心移取上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心移取10毫升上清液到新的15毫升離心管
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體粗提沉淀物
• 加入xx毫升分離液（Reagent E），混勻沉淀顆粒群
• 準(zhǔn)備1個6毫升超速離心管
• 移取xx毫升高純液A（Reagent F）到6毫升超速離心管底部（注意：使用前搖勻高純液A(Reagent F)）
• 輕輕加上xx毫升高純液B（Reagent G）在高純液A（Reagent F）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液B(Reagent G)）
• 輕輕加上xx1毫升高純液C（Reagent H）在高純液B（Reagent G）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液C(Reagent H)）
• 輕輕加上xx毫升高純液D（Reagent I）在高純液C（Reagent H）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液D(Reagent I)）
• 輕輕加上xx毫升高純液E（Reagent J）在高純液D（Reagent I）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液E(Reagent J)）
• 輕輕加上xx毫升上述溶酶體混勻液在高純液E（Reagent J）的上面，避免震動
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心120分鐘，速度為145000g
• 小心收集頂部溶酶體樣品帶到15毫升錐形離心管——此步驟獲得高純溶酶體樣品
• 加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent K）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

三、動物細(xì)胞溶酶體分離（細(xì)胞勻漿法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移取xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（10⁸），直至細(xì)胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細(xì)胞生長表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，
• 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約20至40下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移取上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心移取5毫升上清液到新的15毫升離心管
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體粗提沉淀物
• 加入xx毫升分離液（Reagent E），混勻沉淀顆粒群
• 準(zhǔn)備1個6毫升超速離心管
• 移取xx毫升高純液A（Reagent F）到6毫升超速離心管底部（注意：使用前搖勻高純液A(Reagent F)）
• 輕輕加上xx毫升高純液B（Reagent G）在高純液A（Reagent F）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液B(Reagent G)）
• 輕輕加上xx毫升高純液C（Reagent H）在高純液B（Reagent G）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液C(Reagent H)）
• 輕輕加上xx毫升高純液D（Reagent I）在高純液C（Reagent H）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液D(Reagent I)）
• 輕輕加上xx毫升高純液E（Reagent J）在高純液D（Reagent I）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液E(Reagent J)）
• 輕輕加上xx毫升上述溶酶體混勻液在高純液E（Reagent J）的上面，避免震動
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心120分鐘，速度為145000g
• 小心收集頂部溶酶體樣品帶到15毫升錐形離心管——此步驟獲得高純溶酶體樣品
• 加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent K）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

四、動物細(xì)胞溶酶體分離（化學(xué)處理法）

實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移取xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（10⁸），直至細(xì)胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
• 重復(fù)實驗步驟2一次
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細(xì)胞生長表面
• 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A）
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預(yù)冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入xx微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）
• 加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent K），輕輕搖動試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移取上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為3000g
• 小心移取10毫升上清液到新的15毫升離心管
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得溶酶體粗提沉淀物
• 加入xx毫升分離液（Reagent E），混勻沉淀顆粒群
• 準(zhǔn)備1個6毫升超速離心管
• 移取xx毫升高純液A（Reagent F）到6毫升超速離心管底部（注意：使用前搖勻高純液A(Reagent F)）
• 輕輕加上xx毫升高純液B（Reagent G）在高純液A（Reagent F）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液B(Reagent G)）
• 輕輕加上xx毫升高純液C（Reagent H）在高純液B（Reagent G）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液C(Reagent H)）
• 輕輕加上xx毫升高純液D（Reagent I）在高純液C（Reagent H）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液D(Reagent I)）
• 輕輕加上xx毫升高純液E（Reagent J）在高純液D（Reagent I）的上面，避免震動（注意：使用前搖勻高純液E(Reagent J)）
• 輕輕加上xx毫升上述溶酶體混勻液在高純液E（Reagent J）的上面，避免震動
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心120分鐘，速度為145000g
• 小心收集頂部溶酶體樣品帶到15毫升錐形離心管——此步驟獲得高純溶酶體樣品
• 加入xx毫升預(yù)冷的保存液（Reagent K）
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心20分鐘，速度為20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent K），充分混勻
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次（1克動物組織或 10⁸細(xì)胞）操作
• 所有操作均須嚴(yán)格在4℃或以下狀態(tài)進(jìn)行
• 操作時，須戴手套
• 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）、分離液（Reagent E）和高純液系列
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴(yán)格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為40至80下（或細(xì)胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 對于難以裂解的細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理

10． 使用高純液前，須搖勻后加入 

• 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整高純液的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
• 通常1克動物組織或 10⁸細(xì)胞的溶酶體含量為300微克左右溶酶體蛋白

13． 本產(chǎn)皮可以獲得99％以上純度的溶酶體  

• 溶酶體標(biāo)志酶活性測定，建議使用通用型N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性比色法定量檢測試劑盒—70031.1和純化溶酶體酸性磷酸酶活性比色法定量檢測試劑盒—50318.3 
• 溶酶體形態(tài)和功能染色，建議使用細(xì)胞溶酶體形態(tài)染色試劑盒—10121和純化溶酶體功能中性紅檢測試劑盒—10323 
• 本公司提供系列溶酶體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的溶酶體內(nèi)外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的溶酶體維持正?；钚?/span>
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶