HL10393.1

活體細(xì)胞線粒體膜通道孔（MPTP）紅色熒光（TMRM）檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

活體細(xì)胞線粒體膜通道孔（MPTP）紅色熒光（TMRM）檢測試劑是一種旨在通過四甲基羅丹明甲酯染料，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，一旦釋放到細(xì)胞漿，即刻發(fā)生熒光淬滅，來分析和觀察線粒體膜通道孔活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞線粒體（動物、人體、昆蟲等）膜通道孔活性（開放狀態(tài)）的檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，分辨率高，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。線粒體膜電位的去極化（depolarization），導(dǎo)致膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性，使之線粒體膨脹（swelling），內(nèi)容物釋放。其中鈣離子過度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失。四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），為羅丹明衍生物陽離子染料，作為電勢測定（potentiometric）熒光探針：*，具有親脂性的； 第二，與線粒體內(nèi)膜負(fù)電極結(jié)合而聚集；第三，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。四甲基羅丹明甲酯進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生四甲基羅丹明。四甲基羅丹明進(jìn)入線粒體后，被線粒體俘獲，呈現(xiàn)強(qiáng)烈熒光。一旦線粒體膜通道孔開放，四甲基羅丹明釋放出來而在胞漿重新分布，其熒光性顯著降低。線粒體內(nèi)熒光的變化，表明膜通道孔的開放狀態(tài)。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 30毫升

染色液（Reagent B） 100微升

稀釋液（Reagent C） 10毫升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于貼壁細(xì)胞染色的容器

1.5毫升離心管：用于染色工作液配制和細(xì)胞染色的容器

微型臺式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 貼壁細(xì)胞染色

• 準(zhǔn)備1個細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的預(yù)處理后待測細(xì)胞（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項(xiàng)8）
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A）到1個細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 小心抽去清理液
• 小心沿著孔壁加入500微升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液到1個細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
• 小心抽去染色工作液
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 小心抽去清理液
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

（A）使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――紅色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)

• 使用熒光酶標(biāo)儀檢測（定量檢測）：

放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――RFU降低，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)

• 懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞染色

• 將預(yù)處理后懸浮細(xì)胞或脫離細(xì)胞（1 X 10⁶細(xì)胞）移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，充分混勻 
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃預(yù)熱的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
  • 進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：激發(fā)波長488nm氬離子激光，散發(fā)波長570nm（FL2），觀察10000個細(xì)胞以上――

波峰左移，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片 

2）激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――

綠色熒光減弱，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)

• 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：

1）移取500微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色杯

2）加入500微升清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長540nm，散發(fā)波長580nm――

RFU降低，表明膜通道孔開放活性（MPTP）增強(qiáng)

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（0.5毫升體系/次）操作
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液
• 染色前，所有試劑溶液，除染色液（Reagent B）外，需37℃預(yù)熱
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析
• 孵育時，必須避免光照
• 本產(chǎn)品友好使用于雙重染色或重疊染色
• 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整處理液：

• 可以使用±10nm波長的濾波器
• 可以使用100微摩爾CaCl2處理的樣品作為膜通道孔開放的陽性對照
• 如果膜通道孔為瞬時開放（transient），則熒光緩慢且自發(fā)降低
• 本公司提供膜通道孔抑制劑： 0.2毫摩爾環(huán)胞素A（cyclosporine A）－12226，維護(hù)熒光完整
• 本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰