細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測(cè)定試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書

主要用途

細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過(guò)透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯，在細(xì)胞氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來(lái)定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級(jí)產(chǎn)品，一種*自由通過(guò)細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過(guò)氧化氫、羥自由基或氫氧基、過(guò)氧化基、次氯酸等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）    毫升

染色液（Reagent B）    微升

稀釋液（Reagent C）    毫升

保存液（Reagent D）    毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書    1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液：用于細(xì)胞操作所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于細(xì)胞操作的容器

1.5毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器

血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)

臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

（共聚焦）熒光顯微鏡或：用于觀察熒光細(xì)胞

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 間接法

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備1瓶25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱1分種
• 振動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 加入4毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細(xì)胞直接從這一步驟開始）
• 移取10微升在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)
• 移出1 X 10⁶細(xì)胞到新的15毫升錐形離心管
• 放入臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液，輕柔混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放入臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的xx微升保存液（Reagent D），輕柔混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)冰槽里
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
  • 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：波長(zhǎng)488nm氬離子激光，觀察50000個(gè)細(xì)胞以上――

波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――

綠色熒光增強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1）移取400微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色杯

2）加入xx微升保存液（Reagent D）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――

RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

• 直接法

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀釋液（Reagent C）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出xx微升G染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的待測(cè)細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿率達(dá)70％

（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項(xiàng)4）

• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 小心沿著孔壁加入xx微升含有染色液（Reagent B）和稀釋液（Reagent C）的染色工作液到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 小心抽去含有染色工作液的細(xì)胞培養(yǎng)液
• 小心沿著孔壁加入xx微升37℃預(yù)熱的保存液（Reagent D）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 孵育時(shí)，必須避免光照
• 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整操作用量：

• 根據(jù)細(xì)胞類型，調(diào)整染色工作液使用劑量（1：200至1：1000容量比），避免過(guò)度染色
• 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行細(xì)胞熒光分析 
• 本公司提供陽(yáng)性對(duì)照甲萘醌溶液，觀察細(xì)胞熒光增強(qiáng)現(xiàn)象
• 本公司同時(shí)提供細(xì)胞內(nèi)活性氧初級(jí)熒光測(cè)定試劑盒，滿足不同用戶需求
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品