植物磷脂酶Dα活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑盒

產品說明書

主要用途

植物磷脂酶Dα（Phospholipase Dα）活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑是一種旨在通過磷脂酶Dα、膽堿激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的酶連續(xù)反應系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用比色法來測定植物組織裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等裂解萃取樣品中磷脂酶Dα的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術背景

磷脂酶（phospholipase），是一種脂質水解酶，催化磷脂的水解，產生脂肪酸和其它親脂產物，參與磷脂代謝。磷脂酶家屬有四種類型亞酶，包括A、B、C和D。磷脂酶A（phospholipase A；PLA）主要水解磷脂sn-1（磷脂酶A1催化）和sn-2（磷脂酶A2催化）位置上的乙?；?；磷脂酶B（phospholipase B；PLB）同時水解磷脂的sn-1和sn-2位置上的乙?；?，又稱為溶血磷脂酶（lysophospholipase）；磷脂酶C（phospholipase C；PLC）在磷酸基前水解，釋放二?；视停╠iacylglycerol；DAG）和第二信使分子三磷酸肌醇（inositol triphosphate）；磷脂酶D（phospholipase D；PLD；EC3.1.4.4）在磷酸基后水解，釋放磷脂酸（phosphatidic acid）。植物磷脂酶D，屬于異源性酶（heterogeneous enzyme）家屬成員，與哺乳動物磷脂酶D不同，有4個異構體：α、β、γ和δ：PLDα是磷脂酰肌醇4,5二磷酸（phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate；PIP2）-非依賴性的常見的植物PLD酶，而PLDβ和PLDγ是磷酸磷脂酰肌醇輔因子（polyphosphoinositide cofactor）依賴性；PLDγ在氨基酸序列同源性和生化特性上類似于PLDβ；PLDδ為膜相關性，游離油酸（oleic acid）可以激活。PLDα通過催化特異性磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine；PC）上磷酸二酯鍵（phosphodiester）的水解，產生磷脂酸和膽堿（choline），磷脂酸作為信號分子，進一步水解為二?；视?，與跨膜信號功能、亞細胞結構質膜的降解和重構等有關。同時通過轉移磷脂基團到原生醇類的羥基上的磷脂轉移活性（transphosphatidylation）。PLDα異常將導致細胞膜損害、細胞功能缺失、衰老等密切相關。基于底物磷脂酰膽堿，在磷脂酶Dα的作用下，水解產生為磷脂酸和膽堿后，通過膽堿激酶（choline kinase）、 丙酮酸激酶（pyruvate kinase）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase）系統(tǒng)，測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的峰值變化（340nm 波長），來定量分析磷脂酶Dα的活性。磷脂酶Dα連續(xù)循環(huán)反應系統(tǒng)為：

PLDα 

phosphatidylcholine  +  H2O     →      phosphatidic acid  +  choline

choline kinase

choline  +  ATP  → o-phosphocholine  +   ADP

pyruvate kinase

 ADP  +  phosphoenolpyruvate   →     ATP  +   pyruvate   

lactate dehydrogenase 

 pyruvate  +   NADH    →   lactate  +   NAD^＋ 

（高吸收峰） （低吸收峰）

產品內容

清理液（Reagent A）    60毫升

裂解液（Reagent B）  20毫升

緩沖液（Reagent C）   5毫升

反應液（Reagent D） 500微升

酶促液（Reagent E） 500微升

底色液（Reagent F）   500微升

陰性液（Reagent G）   500微升

產品說明書      1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存－20℃冰箱里；底色液（Reagent F）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存和反應操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

• 樣品準備

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入預冷的1毫升裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 即刻移入到1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 BCA蛋白質濃度定量試劑盒－30031.1）
• 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 測定準備

• 開啟并設定好分光光度儀或酶標儀（溫度為30℃）：波長340nm，并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent F）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 背景對照測定

• 移取170微升緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
• 加入25微升反應液（Reagent D）
• 加入10微升陰性液（Reagent G）
• 渦旋震蕩5秒
• 在30℃溫度下孵育10分鐘，期間渦旋震蕩3次，每次5秒
• 煮沸5分鐘
• 室溫下靜置15分鐘冷卻
• 轉移到250微升比色皿或96孔板
• 加入25微升酶促液（Reagent E）
• 加入20微升底色液（Reagent F）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為0分鐘讀數
• 取出比色皿
• 室溫下孵育20分鐘
• 即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為20分鐘讀數
• 背景空對照讀數＝0分鐘讀數－20分鐘讀數

• 樣品活性測定

• 移取170微升緩沖液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管
• 加入25微升反應液（Reagent D）
• 加入10微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 渦旋震蕩5秒
• 在30℃溫度下孵育10分鐘，期間渦旋震蕩3次，每次5秒
• 煮沸5分鐘
• 室溫下靜置15分鐘冷卻
• 轉移到250微升比色皿或96孔板
• 加入25微升酶促液（Reagent E）
• 加入20微升底色液（Reagent F）
• 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為0分鐘讀數
• 取出比色皿
• 室溫下孵育20分鐘
• 即刻放進分光光度儀或酶標儀檢測，此為20分鐘讀數
• 樣品總活性讀數＝0分鐘讀數－20分鐘讀數

• 計算樣品活性

比色皿計算

[（樣品讀數－背景讀數）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾PC/分鐘

96孔板計算

[（樣品讀數－背景讀數）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 0.6 （光徑距離；厘米）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾PC/分鐘

注意事項

• 本產品為20次操作，包括背景對照
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要 
• 測定值由高到低變化
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 樣本測定0分鐘讀數高于20分鐘讀數表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/10微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  BCA蛋白質濃度定量試劑盒－30031.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 用戶可以使用磷脂酶Dα抑制劑N-月桂酰乙醇胺（N-lauroylethanolamine；12:0；IC50=150納摩爾）作為陰性對照或抑制劑陽性對照
• 磷脂酶Dα單位活性定義為：在30℃，pH 6.5條件下，每分鐘內能夠水解1微摩爾磷脂酰膽堿所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列磷脂酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經鑒定檢測敏感