革蘭氏陰性細(xì)菌外膜囊泡制備試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 

主要用途

革蘭氏陰性細(xì)菌外膜囊泡制備試劑是一種旨在使用差速離心，分離并收集所有細(xì)胞外膜囊泡的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于各種革蘭氏陰性細(xì)菌外膜囊泡及其蛋白的純化。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，萃取產(chǎn)量和純度皆佳。

技術(shù)背景

外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）為含有周質(zhì)內(nèi)容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂質(zhì)、周質(zhì)蛋白、黏附素、免疫調(diào)節(jié)化合物等）的球形電子致密芽狀體（spherical bud），細(xì)胞外間隔體，雙層磷脂，20至200納米大小，來(lái)自于革蘭氏陰性細(xì)菌周邊突起物的釋放形成或胞外分泌產(chǎn)物，使之與環(huán)境或宿主細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，并調(diào)解各種功能，包括促進(jìn)病理形成，調(diào)節(jié)細(xì)菌互動(dòng)，轉(zhuǎn)運(yùn)各種信號(hào)分子（例如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、毒力因子等），保護(hù)細(xì)菌生存、結(jié)合和侵入，引起毒性，產(chǎn)生抗生素抗性等。外膜囊泡的產(chǎn)量取決于細(xì)菌生長(zhǎng)周期、營(yíng)養(yǎng)條件、溫度、氧化應(yīng)激狀態(tài)等。病原菌的外膜囊泡10倍于非病原菌體。外膜囊泡具有疫苗開(kāi)發(fā)中免疫調(diào)節(jié)潛力。通過(guò)差速離心和蛋白酶抑制混合劑，獲得高純外膜囊泡，充分保留其蛋白質(zhì)的免疫和生物學(xué)活性。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存液（Reagent A）        毫升

溶解液（Reagent B）        毫升

活性液（Reagent C）        微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

保存方式

保存活性液（Reagent C）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

分光光度儀：用于測(cè)定細(xì)菌濃度

臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

超速離心機(jī)：用于樣品操作

恒溫?fù)u床：用于培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞

0.45微米濾膜：用于樣品操作

真空濃縮裝置：用于樣品操作

實(shí)驗(yàn)步驟 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒里的活性液（Reagent C）從－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里凍融，然后移出xx毫升溶解液（Reagent B）到1.5毫升離心管，加入xx微升活性液（Reagent C），充分混勻，置于冰槽里，標(biāo)記為溶解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備好1毫升過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮細(xì)菌樣品
• 移取500微升到50毫升細(xì)菌培養(yǎng)液（注意：用戶可以進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，例如無(wú)鐵培養(yǎng)等）
• 放進(jìn)37℃恒溫?fù)u床孵育過(guò)夜，速度為200RPM
• 在分光光度儀上測(cè)OD600為1（1 OD＝1 X 10⁹細(xì)胞/毫升；總量為5 X 10¹⁰細(xì)胞） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心30分鐘，速度為5000g
• 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟6和7一次
• 使用0.45微米濾膜真空過(guò)濾一次
• （選擇步驟）使用100kD蛋白臨界點(diǎn)濃縮處理
• 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心3小時(shí)，速度為150000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升預(yù)冷的保存液（Reagent A）
• 或加入xx微升預(yù)冷的含有 溶解液（Reagent B）和活性液（Reagent C）的溶解工作液
• 用槍頭上下抽吸，充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里保存或置于冰冰槽里備用
• 進(jìn)行后續(xù)蛋白定量、熒光定量或電鏡檢測(cè)等

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（50毫升菌液）操作
• 所有操作須在4℃狀態(tài)下進(jìn)行
• 建議使用新鮮細(xì)菌接種，培養(yǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)階段為理想狀態(tài)
• 活性液（Reagent C）避免反復(fù)凍融
• 本產(chǎn)品按照50毫升培養(yǎng)菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相應(yīng)調(diào)整試劑用量
• 根據(jù)菌種不同，50毫升（OD600＝1）菌液可獲得5至100微克外膜囊泡蛋白
• 制備產(chǎn)物如果放在－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/span>，嚴(yán)格避免反復(fù)凍融
• 本公司提供系列細(xì)菌試劑產(chǎn)品
    

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無(wú)蛋白酶污染