乳酸脫氫酶（LDH）釋放法細(xì)胞繁殖與毒性定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

乳酸脫氫酶（LDH）釋放法細(xì)胞繁殖與毒性定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)酶聯(lián)連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)由于細(xì)胞損傷導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的乳酸脫氫酶釋放到細(xì)胞外，使四唑鹽染料碘硝基氯化四氮唑（INT）還原為紅色甲臜（farmazan），即比色法定量測(cè)定酶活性，以評(píng)價(jià)活體細(xì)胞繁殖的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種藥物、化學(xué)、環(huán)境因子和營(yíng)養(yǎng)因子處理的貼壁或懸浮生長(zhǎng)中的動(dòng)物或人體細(xì)胞。替代傳統(tǒng)的同位素[⁵¹ Cr]釋放檢測(cè)的更佳選擇。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，簡(jiǎn)捷敏感，性能穩(wěn)定，顯色清晰，檢測(cè)準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損害或*裂解導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放外泄到培養(yǎng)液里，其中包括活性穩(wěn)定的乳酸脫氫酶。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）釋放法的測(cè)定是基于在乳酸脫氫酶的作用下，還原NAD⁺反應(yīng)生成的NADH，再與氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（Iodonitrotetrazolium；INT）在硫辛酰胺脫氫酶（diaphorase）的催化下反應(yīng)生成紅色生色產(chǎn)物甲臜（formazan），在490nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸收峰，從而確定釋放的乳酸脫氫酶的活性，作為細(xì)胞膜完整性的標(biāo)志：吸光值與細(xì)胞死亡或毒性程度成線(xiàn)性正相關(guān)。酶聯(lián)連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

裂解液（Reagent A）      毫升

補(bǔ)充液（Reagent B） 毫升

反應(yīng)液（Reagent C）      毫升

顯色液（Reagent D）      毫升

終止液（Reagent E）      毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent F）     微升（另購(gòu)）

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)                         1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，反應(yīng)液（Reagent C）和顯色液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶(hù)自備

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：用于細(xì)胞操作的容器

細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)

孔板離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

酶標(biāo)儀：用于定量檢測(cè)染色后的細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

• 貼壁細(xì)胞檢測(cè)

• 準(zhǔn)備96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)細(xì)胞（每孔100微升）：包括未處理的對(duì)照細(xì)胞（樣品對(duì)照孔），未處理的后續(xù)裂解的細(xì)胞（樣品zui大酶活性對(duì)照孔），以及藥物處理的細(xì)胞（處理樣品孔），并做好標(biāo)記（細(xì)胞密度為每孔2 X 10³至2 X 10⁴細(xì)胞）
• 到規(guī)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1小時(shí)，從濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出待測(cè)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（注意：確保細(xì)胞培養(yǎng)液維持在100微升容量）
• 加入xx微升裂解液（Reagent A）到未處理的后續(xù)裂解的細(xì)胞孔里（樣品zui大酶活性對(duì)照孔）
• 同時(shí)加入xx微升補(bǔ)充液（Reagent B）到其余所有檢測(cè)孔里
• 放回濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱里，繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)，即規(guī)定檢測(cè)時(shí)間
• 從濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出待測(cè)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
• 放進(jìn)孔板離心機(jī)離心10分鐘，速度為250g
• 分別小心移取50微升上清液到新的96孔板的相應(yīng)孔里，避免觸摸細(xì)胞顆粒，同時(shí)注意做好標(biāo)記
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）（注意：使用前，須混勻）
• 分別加入xx微升顯色液（Reagent D） 
• 搖動(dòng)96孔板混勻
• 在室溫下孵育30分鐘，避免光照
• （選擇步驟）分別加入xx微升終止液（Reagent E）
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀里測(cè)讀：波長(zhǎng)490nm
• 計(jì)算處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)：處理樣品孔吸光讀數(shù)－樣品對(duì)照孔吸光讀數(shù)
• 計(jì)算樣品細(xì)胞zui大酶活性的實(shí)際吸光讀數(shù)：樣品zui大酶活性對(duì)照孔吸光讀數(shù)－樣品對(duì)照孔吸光讀數(shù)
• 計(jì)算細(xì)胞毒性或死亡率（％）：

（處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)÷樣品細(xì)胞zui大酶活性的實(shí)際吸光讀數(shù)）X 100

• 或繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為實(shí)際吸光讀數(shù)（A）；橫坐標(biāo)（X軸）為細(xì)胞數(shù)或時(shí)間點(diǎn)或藥物濃度；據(jù)此計(jì)算其LD₅₀

• 懸浮細(xì)胞檢測(cè)

• 準(zhǔn)備96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的待測(cè)懸浮細(xì)胞（每孔100微升）：包括未處理的對(duì)照細(xì)胞（樣品對(duì)照孔），未處理的后續(xù)裂解的細(xì)胞（樣品zui大酶活性對(duì)照孔），以及藥物處理的細(xì)胞（處理樣品孔），并做好標(biāo)記（細(xì)胞密度為每孔5 X 10³至5 X 10⁴細(xì)胞）

• 到規(guī)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1小時(shí)，從濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出待測(cè)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（注意：確保細(xì)胞培養(yǎng)液維持在100微升容量）
• 加入xx微升裂解液（Reagent A）到未處理的后續(xù)裂解的細(xì)胞孔里（樣品zui大酶活性對(duì)照孔）
• 同時(shí)加入xx微升補(bǔ)充液（Reagent B）到其余所有檢測(cè)孔里
• 放回濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱里，繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)，即規(guī)定檢測(cè)時(shí)間
• 從濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出待測(cè)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
• 放進(jìn)孔板離心機(jī)離心10分鐘，速度為250g
• 分別小心移取50微升上清液到新的96孔板的相應(yīng)孔里，避免觸摸細(xì)胞顆粒，同時(shí)注意做好標(biāo)記
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent C）（注意：使用前，須混勻）
• 分別加入xx微升顯色液（Reagent D） 
• 搖動(dòng)96孔板混勻
• 在30℃溫度下孵育30分鐘，避免光照
• （選擇步驟）分別加入xx微升終止液（Reagent E）
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀里測(cè)讀：波長(zhǎng)490nm
• 計(jì)算處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)：處理樣品孔吸光讀數(shù)－樣品對(duì)照孔吸光讀數(shù)
• 計(jì)算樣品細(xì)胞zui大酶活性的實(shí)際吸光讀數(shù)：樣品zui大酶活性對(duì)照孔吸光讀數(shù)－樣品對(duì)照孔吸光讀數(shù)）
• 計(jì)算細(xì)胞毒性或死亡率（％）：

（處理樣品實(shí)際吸光讀數(shù)÷樣品細(xì)胞zui大酶活性的實(shí)際吸光讀數(shù)）X 100

• 或繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為實(shí)際吸光讀數(shù)（A）；橫坐標(biāo)（X軸）為細(xì)胞數(shù)或時(shí)間點(diǎn)或藥物濃度；據(jù)此計(jì)算其LD₅₀

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為100次（1個(gè)96孔板）操作
• 操作時(shí)須戴手套
• 整個(gè)操作須無(wú)菌操作
• 建議每個(gè)樣品安排3個(gè)孔，即重復(fù)3次，計(jì)算時(shí)取其平均值
• 檢測(cè)體系相應(yīng)增加，試劑用量按比例相應(yīng)增加：例如200微升檢測(cè)體系，試劑用量增加1倍
• 每孔中的培養(yǎng)液需100微升，避免使用周邊培養(yǎng)孔（常常液體蒸發(fā)而減少）
• 系統(tǒng)測(cè)試，可以加入10微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到50微升無(wú)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液里，然后加入反應(yīng)液和顯色液即可
• 細(xì)胞裂解效果不佳，可以使用20微升裂解液（Reagent A）處理
• 孵育時(shí)，須避光
• 染色完成后，建議即刻檢測(cè)，zui遲不得超過(guò)1小時(shí)
• 細(xì)胞培養(yǎng)和處理時(shí)，避免使用草酸（OXALATE），草氨酸（OXAMATE）和EDTA，否則影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性
• 血清含有乳酸脫氫酶，建議使用濃度不要超過(guò)1％
• 細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)、密度過(guò)高、離心速度過(guò)大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過(guò)大等因素會(huì)造成細(xì)胞自然釋放乳酸脫氫酶
• 酚紅會(huì)干擾檢測(cè)
• 樣品zui大酶活性對(duì)照孔或zui大OD吸光讀數(shù)與細(xì)胞裂解程度密切相關(guān)
• 如果用戶(hù)沒(méi)有孔板離心機(jī)，則移取上清液時(shí)格外小心
• 如果用戶(hù)沒(méi)有匹配的波長(zhǎng)，可以使用波長(zhǎng)470nm至570nm之間的任一波長(zhǎng)替代
• 本公司提供系列細(xì)胞繁殖檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感