深圳子科生物報(bào)道：蛋白質(zhì)優(yōu)化工程能夠改良抗體、生物酶及其他蛋白質(zhì)如基因編輯酶等，賦予新的特性或提升現(xiàn)有功能，實(shí)現(xiàn)臨床和研究應(yīng)用的需要。修改氨基酸序列是蛋白質(zhì)優(yōu)化工程中的核心技術(shù)之一。近年，CRISPR-Cas基因編輯酶已成為醫(yī)學(xué)研究的重要工具?？茖W(xué)家正努力改良CRISPR-Cas酶，借修改其氨基酸序列，在多點(diǎn)位置換入其它氨基酸，以提高基因編輯的準(zhǔn)確性和效率，以及提升修改致病基因治療的安全性和有效性。

香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院（港大醫(yī)學(xué)院）生物醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)成功開發(fā)一套全新技術(shù)，能夠大量組裝及有系統(tǒng)地引入多點(diǎn)修改到蛋白質(zhì)變體中，并以條形碼編碼同時(shí)分析各個(gè)組合在篩選過程的頻率變化，在眾多組合中尋找出合適的組合修改。

這種新方法被稱為：CombiSEAL，相關(guān)研究成果公布在Nature Methods雜志上，由黃兆麟博士領(lǐng)導(dǎo)完成，目前已提交專li申請(qǐng)。

目前改良CRISPR-Cas酶以及其他蛋白質(zhì)的挑戰(zhàn)，在于從眾多氨基酸序列組合變化中，篩選出合適的氨基酸替代組合。過多或過少的修改，可能對(duì)提高基因編輯酶的準(zhǔn)確性和效率有負(fù)面影響。然而多個(gè)氨基酸變化的組合效應(yīng)難以預(yù)測，并且隨著每個(gè)額外氨基酸的修改，蛋白質(zhì)突變組合數(shù)量也大量增加。傳統(tǒng)定點(diǎn)誘變技術(shù)可逐一產(chǎn)生蛋白質(zhì)變體，但不能建立具有多個(gè)變化的大型氨基酸變體文庫，進(jìn)行大量的同時(shí)平行分析（massively-parallel analysis）。發(fā)展新的技術(shù)平臺(tái)，以大幅提高組裝和分析蛋白質(zhì)變體的能力，有助于加速開發(fā)新一代基因組編輯酶。

在這篇文章中，研究人員開發(fā)了一種新技術(shù)能夠大量組裝，有系統(tǒng)地引入多點(diǎn)修改，這方法比傳統(tǒng)的逐一建構(gòu)及檢測個(gè)別定點(diǎn)突變的變體，更為省時(shí)，且成本可大幅降低，而且更可以直接在人類細(xì)胞表達(dá)基因編輯酶及其他治療性蛋白質(zhì)的活性。

研究團(tuán)隊(duì)將其命名為“CombiSEAL”，利用這一技術(shù)，他們成功篩選出擁有更高基因編輯準(zhǔn)確性的新Cas9基因編輯酶變體。新變體在不損失活性及靶點(diǎn)選擇范圍的同時(shí)，降低基因編輯錯(cuò)誤的可能性。CombiSEAL技術(shù)平臺(tái)易于使用，可以用作高通量篩選并改良更多臨床應(yīng)用的蛋白質(zhì)，提升治療效果。

SpCas9 是CRISPR-Cas系統(tǒng)中被廣泛應(yīng)用的基因編輯酶。研究團(tuán)隊(duì)利用CombiSEAL技術(shù)，快速建造了948個(gè)SpCas9變體，這大型的蛋白質(zhì)文庫中，每個(gè)變體包含1至8個(gè)氨基酸的替代修改。團(tuán)隊(duì)將這文庫遞送到人類細(xì)胞中進(jìn)行測試，有系統(tǒng)地量化每一個(gè)變體的基因編輯效率和準(zhǔn)確性。

在這項(xiàng)研究中，SpCas9蛋白變體的數(shù)量大大*迄今已被報(bào)導(dǎo)的研究的變體總和。團(tuán)隊(duì)成功篩選出可降低基因編輯錯(cuò)誤的兩個(gè)新變體：Opti-SpCas9 和OptiHF-SpCas9，其中Opti-SpCas9擁有較高的基因編輯活性。

CombiSEAL的簡單一鍋式反應(yīng)技術(shù)可制造大型變體文庫，并以短讀測序（short-read sequencing）帶有序列條碼的蛋白變體，分析每個(gè)組合的頻率變化，大幅提高篩選的通量。研究團(tuán)隊(duì)未來可進(jìn)一步擴(kuò)大測試的規(guī)模，從而挑選出更的變體。

這項(xiàng)研究的重要性包括：
（1）港大醫(yī)學(xué)院團(tuán)隊(duì)開發(fā)的CombiSEAL平臺(tái)，突破傳統(tǒng)技術(shù)，引入序列條碼標(biāo)籤蛋白基因的變體，成功以高通量測序方法，快速分析多點(diǎn)氨基酸的變化組合，以瞭解變體組合與蛋白酶活性的關(guān)係。新的技術(shù)平臺(tái)可以廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)室，例如生物醫(yī)學(xué)、應(yīng)用醫(yī)學(xué)，新藥及抗體開發(fā)和生物科技等，實(shí)現(xiàn)高通量表徵及篩選蛋白質(zhì)變體。

黃兆麟博士表示：“這是一個(gè)大規(guī)模的構(gòu)建與測試平臺(tái)，用于尋找*變體組合以優(yōu)化蛋白質(zhì)。一鍋式組裝技術(shù)和引入序列條碼，大大減少了建構(gòu)變體庫及其功能表徵的時(shí)間和成本。”

(2）團(tuán)隊(duì)篩選出新改良的基因組編輯酶變體Opti-SpCas9。黃兆麟博士指出：“Opti-SpCas9的準(zhǔn)確性較高，對(duì)改善基因編輯術(shù)在臨床應(yīng)用的安全性很有幫助，它同時(shí)擁有高編輯效率和保持了廣泛靶點(diǎn)范圍。”Opti-SpCas9與其他新改良的SpCas9變體不同，它是唯yi可用于U6啟動(dòng)子下，可轉(zhuǎn)錄含有額外5'guanine的gRNAs，而不影響其效率的改良版 ；而這個(gè)特質(zhì)有一個(gè)很重要的應(yīng)用，因?yàn)橐M(jìn)行成千上萬sgRNA的大型基因組掃描（CRISPR-based genetic screen），必須要使用效率良好的U6啟動(dòng)子，而Opti-SpCas9正具備進(jìn)行大型掃描所需要條件，因此它將可以廣泛地被應(yīng)用于高通量基因組篩選研究。

黃兆麟博士致力開發(fā)各種基于組合遺傳學(xué)的高通量篩選技術(shù)，用以剖析包括癌癥在內(nèi)等疾病的致病機(jī)理，從而制定新的治療策略。早前的研究工作開發(fā)了用于分析基因相互作用的CombiGEM技術(shù)。研究成果已于2015年在Nature Methods和2016年在PNAS期刊上發(fā)表。此外，該團(tuán)隊(duì)于2016年在期刊《遺傳學(xué)年度回顧》中發(fā)表了一篇評(píng)論文章，闡釋CombiGEM技術(shù)解決生物醫(yī)學(xué)研究的潛力和挑戰(zhàn)。而這項(xiàng)研究中開發(fā)了新的組合遺傳學(xué)技術(shù)CombiSEAL，更開拓了組合遺傳學(xué)于蛋白質(zhì)優(yōu)化工程的全新應(yīng)用。

原文標(biāo)題：

Combinatorial mutagenesis en masse optimizes the genome editing activities of SpCas9