子科生物報(bào)道：堿基編輯技術(shù)（Base Editing）是基于CRISPR系統(tǒng)開發(fā)的基因組定向修飾技術(shù)。該技術(shù)由于不需要DNA雙鏈斷裂和外源供體DNA可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的堿基的精zhun替換，在疾病治療、植物性狀改良等方面具有很大的應(yīng)用潛力。

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組長期致力于植物基因組編輯技術(shù)的創(chuàng)新及應(yīng)用研究，前期已經(jīng)在植物中建立了完善的胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine Base Editor, CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（Adenine Base Editor, ABE）技術(shù)體系（Zong et al., Nat. Biotechnol. 2017; Zong et al., Nat. Biotechnol. 2018; Li et al., Genome Biol. 2018），但是發(fā)現(xiàn)胞嘧啶堿基編輯器在基因組水平存在脫靶效應(yīng)（Jin et al., Science 2019）。為解決這一問題，高彩霞研究組通過對(duì)人類胞嘧啶脫氨酶（APOBEC3B）蛋白的理性設(shè)計(jì)，并結(jié)合新型的胞嘧啶堿基編輯篩選方法，開發(fā)出了新型高精度、高編輯活性的胞嘧啶堿基編輯工具。

研究人員首先在水稻原生質(zhì)體中建立并優(yōu)化了基于R-loop的高通量堿基編輯器特異性評(píng)估方法。該方法利用CBE作用于單鏈DNA的特性，通過SpCas9的正交蛋白nSaCas9在編輯靶點(diǎn)外的基因組區(qū)段誘導(dǎo)R-loop，從而人為制造單鏈DNA（single stand DNA, ssDNA）區(qū)域。如果CBE的脫氨活性在這些區(qū)域產(chǎn)生脫靶編輯，可以通過高通量測(cè)序進(jìn)行富集檢測(cè)。

該工作首先對(duì)已報(bào)道的5個(gè)胞嘧啶堿基編輯器分別通過R-loop方法和全基因組測(cè)序（Whole-genome sequencing, WGS）進(jìn)行特異性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)R-loop方法與 WGS的結(jié)果一致，證明了R-loop方法的可靠性。且該方法與WGS相比，更加快速、便捷和經(jīng)濟(jì)。

在此基礎(chǔ)上，研究人員通過對(duì)一系列理性設(shè)計(jì)的基于人源APOBEC脫氨酶的CBE的特異性進(jìn)行篩選。以編輯效率高且編輯窗口小的A3Bctd（a truncated APOBEC3B deaminase with enzymatic activity）作為蛋白進(jìn)化的原始底盤，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)信息預(yù)測(cè)與其脫氨的催化活性和ssDNA結(jié)合能力相關(guān)的結(jié)構(gòu)域以及這些結(jié)構(gòu)域中的重要氨基酸殘基，通過理性設(shè)計(jì)獲得16個(gè)單氨基酸替換的CBE變體。通過篩選獲得了靶向效率維持較高且能較顯著降低脫靶效應(yīng)的7種單個(gè)氨基酸突變（R211K, T214V,, R311K, Y313F, D314R, D314H 和 Y315M）。

為了進(jìn)一步降低CBE的脫靶效應(yīng)，研究人員將這些單氨基酸突變進(jìn)行組合創(chuàng)制了9個(gè)多氨基酸替換變體，zui終篩選得到了兩種靶向編輯效率較高且特異性顯著增加的CBE變體：A3Bctd-VHM-BE3 和A3Bctd-KKR-BE3。對(duì)編輯產(chǎn)物的分析顯示，這兩種變體在編輯窗口內(nèi)主要產(chǎn)生單個(gè)C或者兩個(gè)C的替換，顯著提升了編輯的精確性。zui后，通過對(duì)150個(gè)水稻編輯植株的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了A3Bctd-VHM-BE3 和A3Bctd-KKR-BE3的高特異性。

該工作結(jié)合基于結(jié)構(gòu)信息的蛋白理性設(shè)計(jì)、植物個(gè)體全基因組脫靶檢測(cè)技術(shù)和高通量R-loop脫靶檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步提高了單堿基編輯的精確性，開發(fā)出的兩種能保持高編輯效率且無隨機(jī)脫靶效應(yīng)的CBE變體，為基因治療和植物分子設(shè)計(jì)育種提供了強(qiáng)有力的工具支撐。

相關(guān)研究成果結(jié)果于2020年7月27日在線發(fā)表在Molecular Cell雜志（DOI:10.1016/j.molcel.2020.07.005)。遺傳發(fā)育所高彩霞研究組博士生靳帥、費(fèi)宏源、朱子旭以及微生物所副研究員駱迎峰為本文的共同第1作者；高彩霞研究員與王延鵬青年研究員為本文共同通訊作者；明尼蘇達(dá)大學(xué)張峰博士，遺傳發(fā)育所陳宇航研究員也參與了這項(xiàng)研究。該研究得到了國家轉(zhuǎn)基因重大科技專項(xiàng)、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)專項(xiàng)A、國家自然科學(xué)基金委和中國科學(xué)院青促會(huì)項(xiàng)目的資助。