生命科學(xué)中的技術(shù)往往會朝著兩個方向發(fā)展，其一就是增加細(xì)胞特征分析數(shù)量，用以同時分析細(xì)胞的不同特點，其二就是增加分析的分辨率，從而提高觀測水平。近幾十年里，流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展?jié)M足了這兩個要求，分析單個細(xì)胞的多種特征，幫助科學(xué)家們了解復(fù)雜或多級細(xì)胞系統(tǒng)中的分子機(jī)理。

 近期研究人員將流式細(xì)胞技術(shù)與質(zhì)譜分析技術(shù)結(jié)合在一起，發(fā)展出了質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（mass cytometry），這種融合技術(shù)能在單細(xì)胞水平上同時分析超過40種細(xì)胞參數(shù)，極大的增加了流式細(xì)胞分析評估復(fù)雜細(xì)胞系統(tǒng)和過程的能力。Cell雜志發(fā)表題為“Mass Cytometry: Single Cells, Many Features”綜述，介紹了質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)目前的現(xiàn)狀，相關(guān)的儀器，主要涉及的應(yīng)用范圍，以及數(shù)據(jù)分析方法，和未來的發(fā)展前景。

 單細(xì)胞分析

 在每年Nature Methods盤點的年度技術(shù)中，總是會出現(xiàn)單細(xì)胞或者單分子之類的技術(shù)，這是因為培養(yǎng)基或者機(jī)體中的細(xì)胞存在多樣性，或者說是異質(zhì)性，這為許多實驗分析造成了障礙?？梢哉f，隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，“平均值”這個詞已經(jīng)不能滿足我們的需要了，我們要了解細(xì)胞之間的差異性，單細(xì)胞研究應(yīng)運而生。

 但是要進(jìn)行單細(xì)胞分析困難重重，從技術(shù)上說也存在幾個方面的問題。首先無論是針對一個特異性大分子，還是在OMIC水平上進(jìn)行分子分析，都存在單細(xì)胞提取物數(shù)量少，難以分析的困難，這甚至可以說是不可能完成的，因此增加靈敏度勢在必行。

 質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)

Mass Cytometry簡單來說，就是利用質(zhì)譜原理對單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測的流式技術(shù)。它繼承了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的高速分析的特點，又具有質(zhì)譜檢測的高分辨能力，是流式細(xì)胞技術(shù)一個新的發(fā)展方向。

 來自多倫多大學(xué)和斯坦福大學(xué)的研究人員曾發(fā)表題為“Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum”的文章，用同位素標(biāo)記抗體，結(jié)合質(zhì)譜分析的方法實現(xiàn)了同時對細(xì)胞表面多達(dá)一百種標(biāo)記物的檢測。

 通常采用的熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測的方法，雖然能實現(xiàn)細(xì)胞分選，但只能夠同時識別6-10種不同顏色的熒光，且還需盡量避免發(fā)生熒光重疊。而這項研究通過這個可以稱為大量細(xì)胞計數(shù)法的方法，觀察了人類骨髓產(chǎn)生的不同形態(tài)細(xì)胞中及表面的34種物質(zhì)，不但能正確歸類10多種不同類型的免疫細(xì)胞，還能觀察到各類免疫細(xì)胞的內(nèi)部變化，從而預(yù)知可能發(fā)生的變化。這將有助于更快更廣泛的測量處方藥對人體細(xì)胞的反應(yīng)及功效，提前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變，研發(fā)出針對個人的治療藥物。

基本原理

質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)的核心當(dāng)然就是兩種實驗平臺的融合了：流式細(xì)胞技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)。目前質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)采用的儀器是CyTOF（Cytometry by Time-Of-Flight），其原理簡單來說是利用質(zhì)譜原理對單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測的流式技術(shù)，既繼承了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的高速分析的特點，又具有質(zhì)譜檢測的高分辨能力。 

傳統(tǒng)流式細(xì)胞技術(shù)和質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)相比，主要有兩點不同：*、標(biāo)簽系統(tǒng)的不同，前者主要使用各種熒光基團(tuán)作為抗體的標(biāo)簽，后者則使用各種金屬元素作為標(biāo)簽；第二、檢測系統(tǒng)的不同，前者使用激光器和光電倍增管作為檢測手段，而后者使用ICP質(zhì)譜技術(shù)作為檢測手段。

此后的CyTOF2也有改進(jìn)，比如ICP質(zhì)譜裝置具有非常寬的原子量檢測范圍（88～210Da），因此可以同時檢測上百個不同的參數(shù)；采用新概念的金屬標(biāo)簽抗體，金屬離子通過多聚螯和物共價的結(jié)合在抗體的不變區(qū)。由于細(xì)胞本身不含這些作為標(biāo)簽的金屬元素，所以沒有傳統(tǒng)流式的“自發(fā)熒光”，信號背景極低。（質(zhì)譜流式技術(shù)——蛋白水平的單細(xì)胞技術(shù)）

在質(zhì)譜流式細(xì)胞實驗進(jìn)行過程中，首先要將目標(biāo)細(xì)胞放在親和試劑混合物(zui常見的是抗體)中溫育，這些親和試劑之前是通過螯合基團(tuán)聚合物鏈共軛連接上純化過的穩(wěn)定重金屬同位素。這些探針綁在細(xì)胞中靶標(biāo)上，可以作為靶標(biāo)表達(dá)水平的報告因子，然后細(xì)胞進(jìn)入單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)霧化，也就是讓細(xì)胞進(jìn)入液滴，從而導(dǎo)入到質(zhì)譜流式細(xì)胞儀中。

進(jìn)入到質(zhì)譜流式細(xì)胞儀中后，細(xì)胞會穿過一個氬等離子體，在那里，共價鍵會斷裂，產(chǎn)生自由原子，并完成充電過程。這樣得到的離子再穿過一個四極桿，去除常見的生物元素，富集重金屬報告離子，在飛行時間質(zhì)譜儀中根據(jù)質(zhì)荷比進(jìn)行分離。離子計數(shù)再轉(zhuǎn)換為電信號，zui終變成一組數(shù)據(jù)，用于之后的分析。

局限性

雖然通過質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)可以同時分析許多的細(xì)胞過程，但這種技術(shù)平臺也存在一些局限性，在設(shè)計實驗的時候要考慮到。

由于細(xì)胞需要霧化和電離，因此分析后是無法恢復(fù)其細(xì)胞活性的，而且由于質(zhì)譜儀中離子飛行動力學(xué)，質(zhì)譜流式細(xì)胞儀的通量要低于熒光分析儀器，同時質(zhì)譜報告因子的敏感度也會下降，量子熒光團(tuán)（如phycoerythrin）越多，就越難以檢測低水平表達(dá)的分子特征。

推薦論文

Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum

2012年，多倫多大學(xué)和斯坦福大學(xué)采用同位素標(biāo)記抗體，結(jié)合質(zhì)譜分析的方法實現(xiàn)了同時對細(xì)胞表面多達(dá)一百種標(biāo)記物的檢測。

通常采用的熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測的方法，雖然能實現(xiàn)細(xì)胞分選，但只能夠同時識別6-10種不同顏色的熒光，且還需盡量避免發(fā)生熒光重疊。

 而這項研究通過這大量細(xì)胞計數(shù)法的方法，觀察了人類骨髓產(chǎn)生的不同形態(tài)細(xì)胞中及表面的34種物質(zhì)，不但能正確歸類10多種不同類型的免疫細(xì)胞，還能觀察到各類免疫細(xì)胞的內(nèi)部變化，從而預(yù)知可能發(fā)生的變化。研究人員利用這一可以追蹤單細(xì)胞多達(dá)45種(潛在性的100種或者更多)的技術(shù)觀察了人類骨髓產(chǎn)生的不同形態(tài)細(xì)胞中及表面的34種物質(zhì)。而且更為重要的是，研究人員不但能正確歸類10多種不同類型的免疫細(xì)胞，還能觀察到各類免疫細(xì)胞的內(nèi)部變化，從而預(yù)知可能發(fā)生的變化。

Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells

哈佛醫(yī)學(xué)院Marc Kirschner等人開發(fā)了兩種方法，能利用微珠將大量不同的DNA條形碼同時傳送到幾十萬納米大小的液滴中。這些方法都利用了微流體裝置來將細(xì)胞和微珠一起裝入這些液滴中。這些液滴是在一個小型裝配線上生成，沿著一根頭發(fā)寬的槽道流動。

這兩種技術(shù)分別為Drop-seq和inDrops。通過Drop-seq或inDrops運行一個批次的細(xì)胞，科學(xué)家們就可以看到整個樣本中表達(dá)了哪些基因——并可以按每個細(xì)胞進(jìn)行排序。

目前如果要生成96個單細(xì)胞表達(dá)譜，成本為一天數(shù)千美元。相比之下，Drop-seq每天只需6.5美分就可生成1萬個單細(xì)胞表達(dá)譜。兩篇Cell文章：廉價的單細(xì)胞基因表達(dá)分析新技術(shù) 

Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry

來自蘇黎世大學(xué)與蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的研究人員開發(fā)出了一種新方法成功綜合分析和顯影了來自患者樣本的腫瘤細(xì)胞。 

這項技術(shù)以醫(yī)院常規(guī)使用的一些方法為基礎(chǔ)，采用一些抗體標(biāo)記非常薄的組織切片上的生物標(biāo)記，抗體偶聯(lián)上純金屬同位素，這樣就無需染料采用純金屬同位素來顯影生物標(biāo)記物，避免了生物樣本分析中顏色數(shù)量有限這一問題。而且這種方法有可能確定哪些細(xì)胞受到了什么影響及其影響的程度。通過這種方法可以找到控制系統(tǒng)的弱點，這有助于開發(fā)一些新的治療方法。

A Continuous Molecular Roadmap to iPSC Reprogramming through Progression Analysis of Single-Cell Mass Cytometry

來自美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員，借助于質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行分析，對細(xì)胞重編程的動態(tài)變化過程有了更全面的認(rèn)識。作者指出，這樣得到的結(jié)果與傳統(tǒng)的熒光流式細(xì)胞術(shù)基本相同，但可讓我們每秒鐘在大約500個細(xì)胞中同時測量40多種不同的參數(shù)。使用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)，該研究小組在重編程的*個3到4周，分析了三個不同的重編程細(xì)胞系。對質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)數(shù)據(jù)集進(jìn)行的時間分辨、高維進(jìn)展分析，可促進(jìn)連續(xù)的重編程分子圖譜的構(gòu)建。本研究所描述的這種方法和數(shù)據(jù)集，為重編程優(yōu)化和其他細(xì)胞重編程機(jī)制研究、以及隨時間動態(tài)變化的復(fù)雜細(xì)胞群研究，提供了寶貴的資源。（子科生物報道）