飛行時(shí)間質(zhì)譜在突變檢測(cè)中的應(yīng)用
MALDI-TOFMS（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜,英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其無(wú)論是在理論上還是在設(shè)計(jì)上都是十分簡(jiǎn)單和的。對(duì)MALDI-TOF質(zhì)譜分析的創(chuàng)新性使用為實(shí)驗(yàn)室提供了基礎(chǔ)、應(yīng)用和臨床研究所需工具。只需10ng的DNA即可檢測(cè)到樣本中的特定位點(diǎn)的變異情況。
近年來(lái)隨著醫(yī)療的需求，臨床中提出了越來(lái)越多的檢測(cè)需求。以非小細(xì)胞肺癌為例，EGFR、KRAS、BRAF、ALK、ROS1、RET、MET、HER-2已經(jīng)成為臨床中常用的檢測(cè)需求。
目前檢測(cè)中，常以熒光定量方法檢測(cè)mutation，F(xiàn)ISH方法檢測(cè)fusion，或者采用NGS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。EGFR需要檢測(cè)的位點(diǎn)散布在18、19、20、21號(hào)外顯子上，采用熒光定量方法往往不能在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行檢測(cè)，需要多個(gè)反應(yīng)來(lái)完成一個(gè)樣本的EGFR基因檢測(cè)，對(duì)樣本量有一定的需求，且由于熒光定量方法需要根據(jù)CT值進(jìn)行結(jié)果的判斷，當(dāng)CT值在35~40個(gè)循環(huán)時(shí)，往往很難判斷。
利用NGS技術(shù)檢測(cè)在樣本量不足以支持一次運(yùn)行時(shí)，成本往往偏高，且整個(gè)NGS的流程往往需要3~5天時(shí)間方可得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)于報(bào)告的速度有一定的限制。那么有沒(méi)有一種技術(shù)在檢測(cè)位點(diǎn)較多時(shí)還可以保證以一個(gè)較快的時(shí)間較低的樣本個(gè)數(shù)需求完成檢測(cè)呢？
MALDI-TOFMS是一個(gè)較優(yōu)的解決方案。主要由基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）組成。其原理是利用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過(guò)程。
而后離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)即測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比 ，檢測(cè)離子。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段，并正扮演著越來(lái)越重要的作用。
基于MALDI-TOFMS技術(shù)的MassARRAY系統(tǒng)是使用質(zhì)譜分析測(cè)量PCR衍生的擴(kuò)增子的非熒光檢測(cè)平臺(tái)。質(zhì)譜分析與終點(diǎn)法PCR相結(jié)合，在通用的循環(huán)條件下實(shí)現(xiàn)了高度多重性的反應(yīng)，以提供、快速且經(jīng)濟(jì)的分析。MassARRAY系統(tǒng)利用有限的加入樣本為靶向基因檢測(cè)提供了*的解決方案。
主要流程分為PCR Reaction——iPLEX Extension Reaction——Mass Spectrometry Analysis首先通過(guò)普通PCR擴(kuò)增得到目的區(qū)段，而后通過(guò)在待測(cè)位點(diǎn)上游1bp位置延伸引物進(jìn)行1bp的延伸反應(yīng)，使產(chǎn)物形成末端為突變型位點(diǎn)/野生型位點(diǎn)的片段，zui后將產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-TOFMS檢測(cè)，zui終質(zhì)荷比（M/Z）與飛行時(shí)間成正比例的關(guān)系即可得到樣本在特定位點(diǎn)的變異情況。
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