SURE Chemically Competent Cell 大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品標(biāo)簽：

SURE；SURE-2；Stbl3；Stable；Direct repeats 正向重復(fù)片段；Retroviral sequences 逆轉(zhuǎn)錄病毒序列；Stratagene;

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產(chǎn)品組分：

菌株描述

SURE菌株是Agilent (Stratagene)公司開發(fā)，特別設(shè)計(jì)用于克隆在傳統(tǒng)的大腸桿菌菌株中“無法克隆”的某些DNA段。SURE菌株破壞了重組酶系統(tǒng)整條通路上的組分，這些組分能催化重組和刪除體內(nèi)的非標(biāo)準(zhǔn)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，包括十字形（由反向重復(fù)序列引起）和Z字形的DNA，經(jīng)常出現(xiàn)在真核生物DNA中，能阻止真核DNA克隆進(jìn)入傳統(tǒng)大腸桿菌菌株中。SURE含限制缺陷（McrA^-, McrCB^-, McrF^-, Mrr^-, HsdR^-），使其無法對(duì)外源DNA進(jìn)行標(biāo)記和限制，從而提高外源甲基化DNA的克隆效率。也含內(nèi)切酶缺陷（endA），和重組缺陷（recB recJ），提高了外源DNA的穩(wěn)定性。存在于F´因子上的lacI^q ZΔM15使菌株適用于藍(lán)白斑。菌株本身含卡那霉素（Kan^R）和四環(huán)素（Tet^R）特性。

SURE菌株基因型：e14-(McrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)].

產(chǎn)品描述

本品是SURE菌株經(jīng)特殊工藝制作所得的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的熱擊轉(zhuǎn)化。經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率＞5×10⁸ cfu/μg DNA。且在-80℃能穩(wěn)定保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

注意事項(xiàng)

1）   感受態(tài)細(xì)胞必須用干冰運(yùn)輸。感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)在-80℃保存，不可反復(fù)凍融且放置時(shí)間過長(zhǎng)，否則會(huì)減低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

2）   zui號(hào)在冰上融化感受態(tài)細(xì)胞。

3）   進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時(shí)，需在相應(yīng)溫度及無菌條件下進(jìn)行。

4）   轉(zhuǎn)化高濃度質(zhì)?；蚋咝蔬B接產(chǎn)物可相應(yīng)降低zui終用于涂板的菌量。

5）   菌株本身含卡那霉素和四環(huán)素特性，攜帶此兩種抗性的質(zhì)粒不適合克隆到SURE細(xì)胞。當(dāng)攜帶抗霉素抗性基因（Cam^R）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入SURE細(xì)胞，使用添加100μg/ml氯霉素的LB固體平板來篩選克隆子。SURE細(xì)胞本身能耐受＜40μg/ml氯霉素，但對(duì)100μg/ml 氯霉素很敏感。

6）   為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可保留部分連接反應(yīng)液以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到zui低。

7）   采用常規(guī)操作流程轉(zhuǎn)化SURE感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×10⁸ cfu/μg DNA。若是對(duì)轉(zhuǎn)化效率要求更高，可使用標(biāo)準(zhǔn)操作流程。

8）   產(chǎn)品包裝內(nèi)含質(zhì)粒pUC19 DNA(10 pg/μl)，供對(duì)照實(shí)驗(yàn)用。

9）   為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

常規(guī)操作流程【所有操作均在無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行】

標(biāo)準(zhǔn)操作流程【所有操作均在無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行】

1）   冰上提前預(yù)冷14ml BD Falcon聚丙烯圓底離心管， 42℃預(yù)熱SOC培養(yǎng)基。

2）   從-80℃取出感受態(tài)細(xì)胞迅速置于冰浴中5min使其*融化。用手輕彈混勻吸取100 μl細(xì)胞到預(yù)冷的14ml離心管內(nèi)。

3）   加1.7μl β-ME（1.42M）到細(xì)胞內(nèi)。【β-ME能提高轉(zhuǎn)化效率】

4）   輕彈管子。置于冰上孵育10min，每2min輕彈混勻細(xì)胞一次。

5）   往細(xì)胞內(nèi)加入0.1-50ng目的DNA，輕彈混勻細(xì)胞，冰上靜置孵育30min。

6）   42℃熱激45s，熱激過程的持續(xù)性非常重要。冰上靜置2min，此過程不要搖動(dòng)離心管。

1）   向每個(gè)離心管中加入900 μl預(yù)熱的無菌SOC培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃ 搖床，225-250 rpm振蕩培養(yǎng)60min，目的使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

2）   吸取≤200 µl 轉(zhuǎn)化菌液，加到含相應(yīng)抗生素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上（若需要顏色反應(yīng)，平板含IPTG+ X-gal），用無菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于室溫（或37℃）直至液體被吸收，倒置培養(yǎng)，37℃過夜培養(yǎng)?！?strong>注意：若是進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，37℃至少培養(yǎng)17h，使得顏色能生成。另外將平板置于4℃孵育2h，能加強(qiáng)顏色反應(yīng)?！?/span>

附表1 固體和液體LB培養(yǎng)基配方

附表2 固體和液體2-YT培養(yǎng)基配方

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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SURE化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（熱激法） SURE化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（熱激法）