Stable Chemically Competent Cell 大腸桿菌化學感受態(tài)細胞

產品標簽：

Stbl3；Stbl2；HB101；Stable；Direct repeats 直接重復片段；Lentiviral expression vectors 慢病毒表達載體；Gibson Assembly 一步法克隆檢測試劑盒；

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產品組分：

菌株描述

Stable菌株是NEB公司開發(fā)的高轉化效率的大腸桿菌菌株，特別適合分離含重復元件和不穩(wěn)定插入序列的質粒克隆，也適合分離和擴繁逆轉錄病毒/慢病毒載體克隆。與商業(yè)化的同源重組反應體系比如NEBuilder HiFi DNA Assembly，Gibson Assembly反應體系和酶切連接體系都兼容。Stable菌株基因型與Stbl2，Stbl3沒有關聯(lián)性，但具有更優(yōu)異的性能（見圖1）?；蚪M含有重組酶recA1 relA1突變，能有效抑制長末端重復序列的重組，降低了錯誤重組的頻率。還含有核酸酶內切酶endA1突變，避免了質粒提取過程中核酸酶的污染，顯著提高制備質粒的產量和質量?；蚪M含有lacZΔM15，適用于藍白斑篩選。菌株本身含鏈霉素和四環(huán)素抗性，在成功轉化后賦予其額外的篩選標志。

Stable菌株基因型：F' proA+B+ lacIq ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14-  Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS-mcrBC

菌株亮點

◇   Stable菌株具有很高的轉化效率，經pUC19檢測轉化效率＞5×10⁸ cfu/μg DNA；

◇   Stable菌株是基因克隆進入腺病毒/慢病毒載體的推薦宿主菌；

◇   Stable菌株是克隆正向重復序列和反向重復序列的推薦宿主菌；

◇   Stable菌株含recA1突變，能減少克隆DNA的重組發(fā)生，從而降低錯誤重組頻率；

◇   Stable菌株含mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，能有效轉化真核來源的甲基化DNA或PCR、cDNA和許多其他來源的非甲基化DNA;

◇   Stable菌株含endA1（非特異核酸內切酶I）突變，確保得到zui高質量和產量的質粒；

◇   Stable菌株含fhuA突變，具有對噬菌體T1的抗性；

◇   Stable菌株含lacZΔM15，適用于具α-互補載體的藍白斑篩選；

產品描述

本品是Stable菌株經特殊工藝制作所得的感受態(tài)細胞，可用于DNA的熱擊轉化。經pUC19質粒檢測轉化效率＞5×10⁸ cfu/μg DNA。且在-80℃能穩(wěn)定保存幾個月轉化效率不發(fā)生改變。

Stable與Stbl3克隆性能（錯誤重組率）的比較

圖1. Stable與Stbl3克隆不穩(wěn)定DNA序列的性能比較。pUC-5xREP含5 x 32bp 重復序列，其在普通大腸桿菌中很不穩(wěn)定。酶切后線性化的pUC19片段2.2ng+1ng 5xREP DNA段配制成重組反應體系，重組反應完成后分別轉化Stable感受態(tài)細胞（A）或Stbl3感受態(tài)細胞（B），復蘇60min，涂布在含50μg/ml羧芐青霉素的LB平板，30℃培養(yǎng)20h。之后做菌落PCR，檢測5xREP DNA插入的穩(wěn)定性（含有正確插入片段的克隆，菌落PCR片段為623bp）。

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在無菌條件的標準下進行】【詳見MKBIO內容】

附表1 固體和液體LB培養(yǎng)基配方

附表2 固體和液體SOC培養(yǎng)基配方

附錄1. Stable感受態(tài)細胞常見問題【詳見MKBio內容】

1.      Stable菌株的基因型和各基因賦予菌株的特征？

Stable基因型：F' proA+B+ lacIq ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14-  Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS-mcrBC

◇   藍白斑篩選（Φ80 Δ(lacZ)M15）：使得β-gal omega段。lacX74去除染色體上的β-gal基因。pUC19和相似基因編碼β-半乳糖苷酶（lacZ）的α肽。α肽與β-半乳糖苷酶的omega段（由F'攜帶，α-互補）結合。當β-半乳糖苷酶按照這種方式重新組合后能正常表達并切割X-gal生成藍斑。當克隆DNA進入質粒破壞α肽基因，使得菌落為白斑。

◇   重組缺陷（recA1）：大腸桿菌（E. coli）本身具修復系統(tǒng)能重組同源序列?；蚪M克隆通常有復制區(qū)，recA介導的重新排列不確定，特別當同源序列長于50bp。recA功能缺失的菌株比recA⁺菌株通常更緩慢生長。

◇   內切酶I缺陷（endA1）：野生型大腸桿菌的周質空間含非特異性內切酶。從這些菌株中制備質粒特別要注意質粒被降解。endA突變去除這個基因，顯著改善了質粒制備物的質粒。

◇   限制缺陷（Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)）：野生型大腸桿菌K12菌株含限制性內切酶，能切割含位點(AAC(N6)GTGC和GCAC(N6)GTT的DNA。雖然大腸桿菌DNA自身受保護，不被同源甲基轉移酶所降解，但外源DNA會在這些位點被切割。限制缺陷刪減了甲基轉移酶和內切酶的基因。

◇   甲基限制缺陷（mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)）：大腸桿菌具有一套酶系統(tǒng)，mcrA，mcrB和mrr能夠切割在高等真核生物和某些植物、細菌菌株發(fā)現(xiàn)的甲基化DNA。來自PCR擴增片段，cDNA或原先在大腸桿菌內擴繁的DNA不會被甲基化，也不會被切割。

◇   T1噬菌體抗性（fhuA）：T1，一種烈性噬菌體需要大腸桿菌羥肟酸鐵吸收受體用來感染。這個基因的刪減賦予對這個噬菌體的抗性，且不會顯著影響轉化或細胞的生長特征。

2.      Stable感受態(tài)細胞能替換Stbl2或Stbl3嗎?

答復：是的

3.      Stable感受態(tài)細胞適合大質粒轉化？

答復：是的

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學和生物技術領域研究的試劑、儀器和實驗室消耗品與實驗服務工作，主要從事細胞生物學、植物學、分子生物學、免疫學、生物化學、蛋白組學。生物制藥與診斷試劑研發(fā)生產等領域。 本公司秉承“以人為本，以誠為信、合同守信”的經營理念。堅持"品質保障"的原則為廣大客戶提供優(yōu)質產品。

Stable化學感受態(tài)細胞（熱激法） Stable化學感受態(tài)細胞（熱激法） ?