NMY51 Chemically Competent Cell

酵母菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

溫馨提示

見(jiàn)我司（懋康生物）整理的酵母雙雜交（Yeast two-hybrid assay）產(chǎn)品專題。

產(chǎn)品關(guān)鍵詞：

Dualmembrane system 雙膜系統(tǒng)；Dualsystems Biotech；Y1HGold；pBT3-STE；pPR3-STE；NMY51；X-α-Gal；Aureobasidin A （AbA）；金擔(dān)子素；

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產(chǎn)品組分：

產(chǎn)品描述

雙膜系統(tǒng)（Dualmembrane system）是由Dualsystems Biotech公司開(kāi)發(fā)的專門篩選跨膜蛋白間相互作用的篩選技術(shù)，該技術(shù)利用分離的泛素系統(tǒng)直接檢測(cè)天然狀態(tài)下膜蛋白間的相互作用，是目前為止為一用來(lái)檢測(cè)膜蛋白間相互作用的酵母雙雜交系統(tǒng)。

雙膜系統(tǒng)利用NMY51酵母菌，能直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行蛋白突變驗(yàn)證或篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)化標(biāo)志為TRP1，leu2-3。報(bào)告基因?yàn)?/span>HIS3，ADE2和LacZ。NMY51的選擇性生長(zhǎng)篩選通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷報(bào)告基因（HIS3，ADE2）進(jìn)行，之后通過(guò)LacZ報(bào)告基因進(jìn)行β-半乳糖分析的定量或半定量篩選，三個(gè)獨(dú)立的報(bào)告基因由不同的啟動(dòng)子調(diào)控，有助于降低假陽(yáng)性幾率。

雙膜系統(tǒng)的工作原理在于：泛素分子量很小，由76個(gè)氨基酸殘基組成。泛素作為降解信號(hào)分子，能夠連接另一個(gè)蛋白的N端，之后被泛素專一性蛋白酶（ubps）識(shí)別，導(dǎo)致與泛素相連蛋白被酶降解。泛素可人為分成兩個(gè)部分：N端（Nub）和C端（Cub）。首先，將泛素Nub的三位異亮氨酸突變成甘氨酸（Nubi突變?yōu)?/span>NuBG），通過(guò)這種方式Cub的親和力明顯降低，避免Cub和Nub自我結(jié)合或靠近的可能性。其次，Cub與合成的LEXA-VP16轉(zhuǎn)錄激活因子融合成融合蛋白Cub-lexa-vp16。正常情況下，NuBG不與Cub結(jié)合，ubps也不能識(shí)別分離的泛素，轉(zhuǎn)錄激活因子也不會(huì)被切下來(lái)。后，將待測(cè)蛋白分別與NuBG和Cub融合，形成bait融合蛋白（bait-cub-lexa-vp16）和prey融合蛋白（prey-NuBG）。如果bait和prey發(fā)生相互作用，促使NuBG和Cub的相互接近，從而被ubps識(shí)別，導(dǎo)致LEXA-VP16的解離，進(jìn)入核內(nèi)，進(jìn)而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)能使用四種Bait質(zhì)粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，篩選標(biāo)志是Leu。三種prey質(zhì)粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，篩選標(biāo)志是Trp。

本品為經(jīng)特殊工藝制備的NMY51酵母菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，用pGADT7質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率＞10⁴cfu/μg DNA。且在-80℃能穩(wěn)定保存三個(gè)月。

基因型

MATa, his3Δ200, trp1-901, leu2-3, 112, ade2, LYS2::(lexAop)4-HIS3, ura3::(lexAop)8-lacZ, ade2::(lexAop) 8-ADE2, GAL4

使用方法

1. Carrier DNA于使用前通過(guò)加熱處理使其變性為單鏈狀態(tài)，方法如下：95-100℃ 水浴或金屬浴3min，快速插入冰中，靜置3min。重復(fù)一次。

2. 取100 µl冰上融化的NMY51化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒2-5 µg，單鏈Carrier DNA 10 µl，PEG/LiAc 500µl，用槍吹打幾次充分混勻，30℃水浴30 min（在15min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻）。

3. 之后將管子放42℃水浴15 min（在7.5min時(shí)翻轉(zhuǎn)6-8次混勻）。

4. 5000 rpm離心40s棄上清，用400 µl ddH₂O重懸沉淀，離心30s棄上清。

5. 用50 µl ddH₂O重懸，涂板，放入29℃培養(yǎng)48-96 h。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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