OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cell

大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品標(biāo)簽：

OverExpress C43(DE3)；C43(DE3) pLysS；BL21 (DE3)；OverExpress C41(DE3)；表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞；毒性蛋白表達(dá)；pET表達(dá)載體；

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菌株描述

OverExpress C41(DE3)、C41(DE3) pLysS、C43(DE3)和C43(DE3) pLysS都是大腸桿菌（E. Coli）菌株，有效表達(dá)不同物種有機(jī)生物體包括細(xì)菌、酵母菌、植物、病毒和哺乳動物來源的毒性蛋白。

OverExpress C43(DE3)菌株來源于OverExpress C41(DE3)菌株，通過篩選OverExpress C41(DE3)對另一個不同毒性蛋白的抗性菌株而獲得。OverExpress C41(DE3)來源于BL21(DE3)，此菌株含一個突變，能降低T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）的水平，從而預(yù)防許多重組毒性蛋白過表達(dá)引起的細(xì)胞死亡。OverExpress C43(DE3)菌與OverExpress C41(DE3)相比，至少攜帶另一個不同突變，使其獲得更廣泛更高的毒性蛋白表達(dá)能力。

OverExpress C43(DE3)菌株含DE3區(qū)，表明該菌株染色體上整合λ噬菌體DE3溶原體（其上攜帶lacUV5啟動子調(diào)控的T7 RNA聚合酶基因），適用于靶基因克隆進(jìn)入T7啟動子表達(dá)載體比如pET系列的蛋白生產(chǎn)。

OverExpress C41(DE3)菌株基因型：F–ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)

產(chǎn)品描述

本品是大腸桿菌OverExpress C41(DE3)菌株經(jīng)特殊工藝制作所得的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的熱擊轉(zhuǎn)化。經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率＞2×108 cfu/μg DNA。且在-80℃能穩(wěn)定保存幾個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

產(chǎn)品包裝

保存與運(yùn)輸條件：

保存：-80℃保存，六個月有效。

運(yùn)輸：干冰運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 感受態(tài)細(xì)胞必須用干冰運(yùn)輸。感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)在-80℃保存，不可反復(fù)凍融且放置時間過長，否則會減低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

2） 在冰上融化感受態(tài)細(xì)胞，不可在冰上放置時間過長，長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率。

3） 進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時，需在相應(yīng)溫度及無菌條件下進(jìn)行。

4） 為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可保留部分連接反應(yīng)液以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到zui低。

5） 產(chǎn)品包裝內(nèi)含質(zhì)粒pUC19 DNA(10pg/μl)，供對照實(shí)驗(yàn)用。

6） 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

7） 誘導(dǎo)時，IPTG濃度范圍可選：0.1~2mM。

8） 為了得到足量的蛋白，需就誘導(dǎo)時間、溫度、IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化。

9） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法【所有操作均在無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行】

1） 從-80℃冰箱取出取感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物），用手輕彈管底輕輕混勻（避免用槍吸打），冰浴靜置25min。

2） 42℃水浴熱激45s，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2min。此過程不要搖動離心管。

3） 向每個離心管中加700 μl無菌的2YT或LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃ 搖床，200 rpm振蕩培養(yǎng)60min，目的使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

4） 低速離心收菌（比如5000rpm，1min），留取100μl左右上清，用槍輕輕吹打重懸菌塊，之后加到篩選抗生素的2YT或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于室溫（或37℃）直至液體被吸收，倒置培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)過夜。

【注意】：

a）涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整。若轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可不用離心，直接取少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，若轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，則通過離心（5000 rpm，1min）后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。

b）新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養(yǎng)。

c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少，可以將剩下的菌液再涂布新培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

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附錄I 蛋白誘導(dǎo)步驟（僅作參考）

1）從新鮮涂布平板上挑取一單克隆，轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的5ml LB液體培養(yǎng)基內(nèi)。

2）37℃搖菌培養(yǎng)過液。為了最小化誘導(dǎo)前目的蛋白的最小化表達(dá)，添加葡萄糖（終濃度為0.2% w/v）到生長培養(yǎng)基內(nèi)。

3）將步驟2）中過夜培養(yǎng)的菌液吸取0.5ml接種到含相應(yīng)抗生素的50ml LB液體培養(yǎng)基內(nèi)。

4）37℃搖菌培養(yǎng)直至OD600達(dá)到0.6~0.8。

5）加入IPTG使其終濃度為1mM。目的蛋白的誘導(dǎo)時間可能在2~16h，依蛋白而異。

6）37℃培養(yǎng)3~4h。為了確定目的蛋白的誘導(dǎo)時間，建議作一個時間周期優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，范圍從2~16h。

7）將培養(yǎng)物冰浴10min。4℃，5,000 x g離心10min收集菌株。

8）吸掉上清，將沉淀保存在-20℃（也能保存在更低的溫度）。

IPTG母液（1M）配制

稱量2.38g IPTG（Mw: 238.30）溶于適量去離子水，充分溶解后，調(diào)整終體積到10ml，并過濾除菌，即得到1M ITPG母液。

— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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