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裂解方法包括化學裂解、酶裂解和機械裂解。化學裂解和酶裂解通常是比較溫和的方法,通常會很少使DNA 斷裂。這兩種方法(包括SDS 和*處理等)提取純化DNA中常用的方法。機械裂解可以更均一的裂解細胞,同化學裂解相比,機械處理具有更高的裂解效率和更低的選擇性。機械處理可以更劇烈和全面的裂解細胞,但也會造成DNA 的斷裂。
一、機械裂解法主要有以下兩種:
1、熱休克(Thermal shock),既反復凍溶法,是一種常用的機械裂解方式比,通常由冷凍和解凍兩部分組成(freezing and thawing)。原理:由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結(jié)構(gòu)破碎。冷凍通常在液氮或-20°C冰上進行,解凍可以在37、50、65 或100℃水浴中進熱休克比化學裂解溫和,但是很有效,有資料表明用熱休克和*與SDS的方法獲得了90%的細胞裂解率。
2、超聲波處理(Ultrasonication)既利用超聲加熱的方法,把細胞破碎。但這種處理會導致DNA 的斷裂,所以加熱不宜過劇烈,要設(shè)定好超聲時間和間隙時間,一般超聲時間不超過5秒,間隙時間大于超聲時間,這些都有利于保護酶的活性。bead-beating 也是常用的機械處理方式,有報道指出bead-beating 比熱休克和化學裂解的細胞裂解效果更好 雖然DNA產(chǎn)量較高,但通常得到的DNA片段較小。
二、 化學裂解和酶裂解法(在提核酸時聯(lián)合使用)
主要是裂解液處理法,細胞裂解液的主要目的有以下幾種:(1)利用去污劑破壞脂質(zhì)雙分子層,破裂細胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白變性使其穩(wěn)定;(4)抑制蛋白酶活性。
主要根據(jù)不同的目的,裂解液的組成有所不同,主要有提取核酸和蛋白兩中。在提取RNA或DNA時,我們主要是要充分裂解細胞,得到更多的核酸;如果我們的目的是蛋白,那要根據(jù)蛋白的位置、特性等因素考慮裂解液,在提取蛋白后,再根據(jù)實驗需要復性蛋白等。以下是中常用試劑和其作用:50 mM Tris-HCl pH 7.4(緩沖體系),150 mM NaCl(等滲體系),1 mM PMSF (強大的蛋白酶抑制劑),1 mM EDTA(變性劑和穩(wěn)定劑),5 µg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制劑),5 µg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制劑),1% Triton x-100(破壞細胞),1% Sodium deoxycholate(中度變性劑和蛋白溶解劑),0.1% SDS(強變性劑和蛋白溶解劑)。7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等。
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