一、抗體的結構與功能
1、抗原：進入動物體內(nèi)對肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。
    包括：蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細菌、各種細胞等。
    特點：外源性、結構性（分子表面具有穩(wěn)定的環(huán)狀結構基團作為識別位點）、特異性（抗原與抗體的反應）。
2、抗體
    動物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)的影響的糖蛋白，存在于血清中，本質(zhì)是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。
    動物脾臟有上百萬個B淋巴 細胞，一個細胞就是一個克隆，它針對抗原上的一個抗原決定族產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。
    一種抗原通常具有多個不同的抗原決定族，因此能刺激多個B淋巴細胞產(chǎn)生相應的單克隆抗體，因此血清中的抗體是針對不同抗原決定族的單克隆抗體混合物，稱為多克隆抗體。
二、單克隆抗體的制備
• 動物免疫與親本細胞的選擇
• 細胞融合：淋巴細胞雜交瘤的制備
•雜交瘤細胞的篩選：有限稀釋法等
•單克隆抗體的制備和凍存
• 單克隆抗體的純化
•親本細胞的選擇：骨髓瘤細胞：一般不分泌抗體，能在體外無限繁殖和連續(xù)繼代培養(yǎng)，且為HPRT－（次黃嘌呤*磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）或TK－（胸腺嘧啶核苷激酶） 。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤細胞。[小鼠骨髓瘤細胞能在體外無限增殖傳代并不分泌抗體。腫瘤細胞DNA生物合成有兩條途徑：一條由糖、氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，這是主要途徑。這條途徑可被*的拮抗物—氨基喋呤(A)所阻斷(但如果培養(yǎng)基中含核苷酸“前體“次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，即便有A存在，細胞通過另一途徑(稱替代途徑或應急途徑)也可合成核苷酸。但后一途徑需次黃嘌呤*磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶 (TK)存在)。
• 淋巴細胞：經(jīng)過免疫處理的淋巴細胞，多用大鼠或小鼠。
• 免疫方法：對細胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏*佐劑混合乳化后，注入到動物體內(nèi)。  
•細胞融合：將免疫脾細胞和小鼠骨髓細胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)，1200rpm離心7¡ª10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細胞鋪展成薄層，在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG 0.5ml，隨后靜置90秒，再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5－10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。
HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞
• 細胞團塊分散后，加HAT溶液，即可加入有飼養(yǎng)細胞的96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml，
• 用HAT選擇性培養(yǎng)時隔4－5天換液，8-10天后可以選擇檢測。
•HAT選擇系統(tǒng):HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細胞DNA合成有關。
•DNA合成途徑有兩種。1.主要途徑2.次要途徑：
• 雜交瘤技術中，常選用次黃嘌呤*磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤細胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤細胞為親本之一。
• HPRT-細胞的嘌呤只能由全合成途徑產(chǎn)生；
•TK- 細胞的嘧啶只能由全合成途徑合成。
•含氨基喋呤培養(yǎng)基抑制了細胞內(nèi)嘌呤和嘧啶的全合成途徑。
•淋巴細胞具有合成DNA的兩條途徑。
•雜zhong細胞通過互補作用獲得HRPT或TK基因，可應用培養(yǎng)基中次黃嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通過補救合成途徑合成DNA。
•在HAT培養(yǎng)基中，HPRT- 或TK-  親本細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有雜zhong細胞存活。
特異性雜交瘤細胞的篩選
• 通過選擇性培養(yǎng)后生長的雜交瘤細胞，僅有部分是分泌預定特異性抗體的雜交瘤細胞?？扇∩锨逡?，根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體類型及所需靈敏度等具體情況來加以選擇。
•雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng):利用單個細胞培養(yǎng)技術選育出遺傳穩(wěn)定的分泌特異抗體的細胞系。
•在培養(yǎng)過程中，一般要加能釋放某些生長因子促進雜交瘤生長的飼養(yǎng)細胞，如小鼠的腹腔巨噬細胞、脾細胞
•或胸腺細胞等。
• 方法有有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法、顯微操作法、應用熒光激活分選儀等。
•有限稀釋法: 通過適當?shù)南♂屵_到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的
  1）取出陽性孔內(nèi)的細胞進行計數(shù)
   2）用培液將其稀釋到例如每毫升內(nèi)10個細胞。
  3）如果在96孔板內(nèi)每孔加0.1ml，其機率將為每孔內(nèi)落入一個細胞。
  4）加入一定數(shù)量的飼養(yǎng)細胞，經(jīng)過2~3天后，可觀察到有集落生長的孔，并標記單克隆。10天左右可以檢測。
   5）根據(jù)檢測的陽性結果再次進行克隆化。
•誘生腹水
• 將穩(wěn)定分泌單抗的細胞株，通過擴大培養(yǎng)，接種于Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔內(nèi)增殖，從而得到大量含單抗的腹水。
•方法是將降植烷或石蠟油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接種3~5×106  雜交瘤細胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中約含1~10mg單抗。