ELISA實(shí)驗(yàn)方法匯總
ELISA實(shí)驗(yàn)步驟：
1、試劑準(zhǔn)備：根據(jù)選擇的試劑盒準(zhǔn)備好相關(guān)試劑。
2、樣品準(zhǔn)備：血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織標(biāo)本等。
3、試劑的配置
4、抗體包被：Coating Buffer: 稀釋成Coating Buffer （1×），根據(jù)產(chǎn)品說明書稀釋抗體，每孔加入100ul預(yù)稀釋的抗體，4°C過夜孵育（16-18h）。
5、使用前，將所有試劑充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。
6、根據(jù)實(shí)驗(yàn)孔（空白和標(biāo)準(zhǔn)品）數(shù)量，確定所需的板條數(shù)目。樣品（含標(biāo)準(zhǔn)品）和空白都應(yīng)做復(fù)孔。
7、加樣：100 μL/well 加入稀釋后的 Cytokine standard 至標(biāo)準(zhǔn)品孔，100 μL/well 加入樣
品至樣品孔，100 μL/well 加 Dilution buffer R (1×)入空白對照孔。
8、加檢測抗體：根據(jù)產(chǎn)品說明書加入 Biotinylated antibody 。 混勻后蓋上封板膜，室溫孵育。
9、洗板：扣去孔內(nèi)液體，300 μL/well 加入 1×washing buffer；停留 1 分鐘后棄去孔內(nèi)液體。重復(fù) 3 次，每一次在濾紙上扣干。
10、加酶：根據(jù)產(chǎn)品說明書加入稀釋好的酶，孵育。
11、洗板：重復(fù)步驟 5 。
12、顯色：100 μL/well 加入 TMB，室溫（18-25℃）避光孵育5-30分鐘之間，根據(jù)孔內(nèi)顏色的深淺（深藍(lán)色）來判定終止反應(yīng)。 通常顯色 10-20 分鐘可以達(dá)到很好的效果。
13、終止反應(yīng)：迅速 100 μL/well 加入 Stop solution 終止反應(yīng)。
14、讀板：終止后 10 分鐘內(nèi)，用檢測波長（measurement wavelength）450 nm 讀值。推薦用雙波長即檢測波長（measurement wavelength）450 nm 、參考波長或校正波長（reference wavelength ）610-630 nm 同時讀板，測量結(jié)果會更準(zhǔn)確。
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