上海研盟生物--Western Blotting實驗問題解答
1、膠片上存在反轉(zhuǎn)印象（如：亮的條帶、黑的背景）？
原因：HRP的濃度過高；
解決：稀釋HRP至少10倍。
2、膜上有黃色或棕色的沉積？
原因：HRP的濃度過高；
解決：稀釋HRP至少10倍。
3、在暗室中條帶過于明亮？
原因：HRP的濃度過高；
解決：稀釋HRP至少10倍。
4、條帶的發(fā)光時間持續(xù)了至少8小時？
原因：HRP的濃度過高；
解決：稀釋HRP至少10倍。
5、信號太弱或沒有？
原因：
1.太多的HRP積聚導致信號快速的消退；
2.抗原或抗體的濃度不夠；
3.轉(zhuǎn)印不成功；
4.HRP或其他底物的效價降低。
解決：
1.稀釋HRP至少10倍；
2.增加其濃度；
3.尋找合適的轉(zhuǎn)移方法和條件；
4.選擇其他的合適底物。
6、背景高？
原因：
1.HRP濃度過高；
2.封閉無效；
3.不適合的封閉試劑；
4.洗滌不充分和洗滌液的量；
5.膠片曝光過度；
6.抗原或抗體的濃度太高。
解決：
1.稀釋HRP至少10倍；
2.尋找合適的封閉方法；
3.選用其他的封閉試劑；
4.增加洗滌的時間,次數(shù)；
5.減少曝光時間；
6.稀釋抗原或抗體。
7、蛋白質(zhì)條帶上有空泡影像？
原因：
1.蛋白質(zhì)沒有被充分轉(zhuǎn)??；
2.膜沒有預先浸濕；
3.在膠片和膜之間有氣泡。
解決：
1.尋找合適的轉(zhuǎn)移方法和條件；
2.在轉(zhuǎn)印前充分浸濕；
3.在暴光之前趕走氣泡。
8、膠片上背景彌散？
原因：HRP標記的抗體出現(xiàn)了積聚；
解決：稀釋HRP至少10倍。
9、無特異性條帶？
原因：
1.HRP濃度過高；
2.SDS促使非特異蛋白質(zhì)條帶黏附在目的蛋白質(zhì)條帶上。
解決：
1.稀釋HRP至少10倍；
2.在操作過程中不要加SDS。
