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桿狀病毒滴度檢測

閱讀：309發(fā)布時間：2018-1-23

桿狀病毒滴度檢測

實(shí)驗原理

根據(jù)噬菌斑數(shù)計算病毒滴度。

實(shí)驗試劑

1. 4% agarose gel：2g agrose 50ml 水，高壓滅菌

2. 2×Grace（unsupplemented）：9.14g粉末（invitrogen） 0.07gNaHCO3 H2O，調(diào)PH6.1，定容至100ml，無菌過濾

3. supplemented Grace：1×Grace添加3.33mg/ml Lactalbumin，3.33mg/ml yeastolate，無菌過濾

4. 高溫滅活FBS

實(shí)驗設(shè)備

1. 6孔板

2. 12ml離心管

3. 100ml無菌玻璃瓶

4. 無菌吸管

5. 70℃水浴鍋

實(shí)驗材料

桿狀病毒， SF9：5×105cells/ml

實(shí)驗步驟

1. 無菌條件下，2ml/孔細(xì)胞（5×105cells/ml）種入6孔板，室溫孵育1h使其貼壁，孵育后鏡檢其貼壁程度；

2. 將4% agarose gel放入70℃水浴鍋融解，空100ml無菌瓶與2×Grace放入40℃水浴鍋預(yù)熱；

3. 將桿狀病毒用無血清supplemented Grace梯度稀釋：10-1~10-8。 

4. 棄6孔板內(nèi)上清，快速加入稀釋好的病毒，1ml/孔，復(fù)孔，室溫孵育1h。

5. 配置上層瓊脂：加20ml高溫滅活FBS到2×Grace 100ml，25ml 2×Grace（含F(xiàn)BS） 12.5ml 無菌水 12.5ml 4% agarose gel，至預(yù)熱的100ml無菌瓶，輕輕混勻，放入37℃水浴鍋備用；

6. 棄6孔板內(nèi)上清，快速加2ml上層瓊脂，以防菌層干燥，靜置10-20min使其凝固；

7. 將6孔板放入27℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4－10天；

8. 計數(shù)板中噬菌斑，直至連續(xù)兩天無變化，加1mg/ml中性紅0.5ml，室溫孵育2h后計數(shù)噬菌斑。

注：

病毒滴度（pfu/ml）=1/稀釋倍數(shù)×噬菌斑數(shù)×1/每孔接種體積


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