魚腥藻毒素a 檢測試劑盒說明書
注意：在使用前請認(rèn)真閱讀說明書（請以英文為準(zhǔn)，中文僅供參考）
1、概述
ABR魚腥藻毒素a檢測試劑盒利用受體結(jié)合的原理。適用于定量或定性檢測水樣中魚腥藻毒素a的含量。其他樣品的提取步驟請與我公司。如果有必要陽性樣品可以通過HPLC, GC/MS或其他的傳統(tǒng)方法證實(shí)測定結(jié)果。
2、安全說明
標(biāo)品中含有少量魚腥藻毒素a，底物中含有四甲基聯(lián)苯胺，終止液也含有稀硫酸。要避免接觸到皮膚和粘膜。如果不小心接觸了請用大量的水沖洗。
3、儲存和穩(wěn)定性
魚腥藻毒素a檢測試劑盒應(yīng)該保存在4–8°C。在使用之前試劑盒中的試劑要恢復(fù)到室溫（20-25°C）。試劑盒在有效期內(nèi)可以使用。酶標(biāo)物需要現(xiàn)配，配好的酶標(biāo)物溶液只能在冰凍保存1周。4、原理
魚腥藻毒素a檢測試劑盒的原理是基于魚腥藻毒素a與受體結(jié)合的反應(yīng)。如果樣品中含有魚腥藻毒素a，會與*標(biāo)記的α-金環(huán)蛇毒素競爭受體（nAChRs）的結(jié)合位點(diǎn)，洗板后加入鏈霉親和素酶標(biāo)物與*結(jié)合，再洗板加入底物顯色，溶液顏色深淺與魚腥藻毒素a的含量成反比。通過做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每個樣品中魚腥藻毒素a的含量。
5、魚腥藻毒素a 檢測試劑盒的限制和可能的干擾
樣品中的很多易出現(xiàn)的有機(jī)物和無機(jī)物已經(jīng)被檢測表明對試劑盒的檢測沒有干擾。然而由于樣品中化合物的多變性引起的基質(zhì)效應(yīng)是不可能*避免的。魚腥藻毒素a在光照或者高pH條件下會降解，所以如果樣品暴露在光照或者高pH條件會造成魚腥藻毒素a含量偏低。后面有樣品處理部分，可以先看看如何合理處理樣品。在使用的過程中出現(xiàn)失誤也會影響結(jié)果，比如：試劑盒保存條件不對、錯誤的加液順序、試劑的量沒有加準(zhǔn)確、孵育的時間太長或太短、孵育的溫度太高或太低（低于35°C或高于40°C），顯色反應(yīng)溫度太高或太低（低于16°C或高于20°C）。和其它檢測方法一樣對陽性結(jié)果要求通過其它傳統(tǒng)的方法來驗(yàn)證。
6、魚腥藻毒素a 檢測的重要性
魚腥藻毒素a是由藍(lán)藻產(chǎn)生的生物堿神經(jīng)毒素。在藍(lán)藻毒素中 是zui毒的一種。人或者動物體內(nèi)的肌肉神經(jīng)接點(diǎn)是魚腥藻毒素a的一個靶標(biāo)（魚腥藻毒素a也能穿過血腦屏障），肌肉神經(jīng)接點(diǎn)把信息從突觸前的神經(jīng)終端傳達(dá)到突觸后的肌肉，同時乙酰*會釋放出來，激活肌肉的乙酰*受體，激發(fā)一系列的事件是肌肉收縮。大部分的乙酰*會被肌肉神經(jīng)接點(diǎn)處的乙酰*酯酶分解。魚腥藻毒素a作為一種乙酰*受體激動劑，效能是乙酰*的20倍，但不能被乙酰*酯酶分解，會使肌肉終板持續(xù)去極化，過度刺激肌肉，導(dǎo)致肌肉疲憊和麻痹。注射魚腥藻毒素a5分鐘，就會出現(xiàn)抽搐、心律失常、呼吸麻痹，zui后窒息而死。
人和動物可能會注射含有魚腥藻毒素a的針劑或者喝到含有魚腥藻毒素a的水而中毒。鑒于此毒素的危害，很多國家已經(jīng)開始對水中的魚腥藻毒素a進(jìn)行檢測。新西蘭規(guī)定魚腥藻毒素a的zui大可接受量為6.0ug/L。
魚腥藻毒素a檢測試劑盒可以檢測43個樣（雙樣），同時需要的樣品量幾個毫升，整個實(shí)驗(yàn)可以在3.5
小時內(nèi)完成。
工作指導(dǎo)
A 試劑盒組成（18）
1、96孔板：包被有乙酰*受體，1塊（12條×8孔）。
2、標(biāo)品緩沖液：1瓶(6mL)。
3、樣品緩沖液：1瓶(6mL)。
4、魚腥藻毒素a標(biāo)品：5瓶（1mL）0，5，25, 125，and 500 ng/mL (ppb)。
5、*標(biāo)記的α-金環(huán)蛇毒素：1瓶（6mL）。
6、鏈霉親和素酶標(biāo)物（HRP)：1瓶。
7、酶標(biāo)物稀釋液：1瓶（12mL）
8、樣品稀釋液：1瓶（25ml）
9、5×濃縮洗液：1瓶（100ml）,使用前按比例稀釋
10、底物顯色液（TMB）:1瓶（16ml）
11、終止液：1瓶（12ml）。
B、試劑盒未提供的材料
1、微量移液器及一次性吸頭（(20-200 μL)
2、多道移液器（50-250ul）及吸頭
3、純凈蒸餾水
4、量筒
5、500ml容量瓶（用于配洗液）
6、保鮮膜
7、計時器
8、吸水紙巾
9、37°C孵育器
10、酶標(biāo)儀（波長450nm）
C、樣品收集和處理
收集水樣放在棕色玻璃瓶冷藏，5天內(nèi)檢測。樣品需要保存5天以上的要冰凍起來。不要把樣品暴露在自然或者人造光線中，因?yàn)楣鈺刽~腥藻毒素a分解。不要用可以升高pH值的試劑來保存樣品。在提取或者濃縮樣品時可以調(diào)整pH值，短暫的暴露于高pH環(huán)境是不會對很嚴(yán)重的影響結(jié)果的，就是不要*的暴露于高pH環(huán)境。
如果總的魚腥藻毒素a（游離的和結(jié)合細(xì)胞的）都要檢測，檢測前先要用合適的方法（反復(fù)凍融，超聲波裂解等）使細(xì)胞裂解。
如果有機(jī)質(zhì)太多先要過濾再檢測（如果檢測總的魚腥藻毒素a要先融解再過濾，否則可能過濾掉細(xì)胞結(jié)合的毒素）。
D、測試準(zhǔn)備
1、微量移液器和吸頭是必須使用的，*使用排槍來添加結(jié)合物、底物和終止液，這樣可以保證整個酶標(biāo)板的孵育時間一致。在做同一次測試時要使用同一個盒子里的試劑和標(biāo)準(zhǔn)。
2、使用前將所有的試劑拿到室溫（19℃-25℃）
3、板是由12條8孔的微孔組成，每次使用不要超過6條，要不可能出現(xiàn)飄移。一次檢測使用多于6條可能出不準(zhǔn)確的結(jié)果。
4、從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。置于4-8℃保存。
5、標(biāo)品液、緩沖液、*標(biāo)記的阿爾法金環(huán)蛇毒素、底物和終止液可直接使用，無需再稀釋。
6、酶標(biāo)物是凍干的（4瓶），每次檢測前計算好酶標(biāo)物的用量，（1瓶可以夠用于30個孔個檢測）陪酶標(biāo)物溶液時，1瓶加入3.5mL酶標(biāo)稀釋液，震蕩混勻，新配好的酶標(biāo)物溶液只能冰凍保存一個星期。如果一次用到多瓶，要把他們合并一起，用前混勻。
7、以1：5的比例稀釋洗液（如果要使用一整瓶那么100ml洗液+ 400ml蒸餾水或無離子水）。
8、由于終止液中包含酸，拿的時候要小心。
E、工作計劃
板是由12條8孔的微孔組成，每次使用不要超過6條，要不可能出現(xiàn)飄移。一次檢測使用多于6條可能出不準(zhǔn)確的結(jié)果。每次檢測都要用同一次的標(biāo)準(zhǔn)曲線，不能用之前的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Std 0-Std 4: 標(biāo)準(zhǔn)(Std 0-Std 4: 0; 5; 25; 125; 500ppb）
Sam1, Sam2, etc.: 樣品
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Std0 Std4 etc
B Std0 Std4 etc
C Std1 Sam1
D Std1 Sam1
E Std2 Sam2
F Std2 Sam2
G Std3 Sam3
H Std3 Sam3
F、檢測步驟
使用前將試劑盒和樣品處理物提前從冰箱中拿出來使其達(dá)到室溫。從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。
1、在對應(yīng)的微孔中分別加入25μL標(biāo)準(zhǔn)緩沖液或者樣品緩沖液。
2、在對應(yīng)測試孔加入100 μL 標(biāo)品溶液和樣品。輕輕敲打或者來回移動來混勻，用保鮮膜蓋好板，37°C孵育2小時。
3、每個測試孔加入50μL*標(biāo)記的阿爾法金環(huán)蛇毒素，用膠帶蓋上，輕微擺動酶標(biāo)板30s混合液體；在37°C下孵育30分鐘。
4、孵育完成后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用250μL1x洗液洗板，然后倒掉，拍板，去掉殘留的洗液，洗板3次。
5、每個測試孔加入100μL酶標(biāo)溶液。輕微擺動酶標(biāo)板30s混合液體；在37°C下孵育30分鐘，避免陽光直射。
6、孵育完成后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用250μL1x洗液洗板，然后倒掉，拍板，去掉殘留的洗液，洗板3次。
7、每個測試孔加入150μL底物，輕微擺動酶標(biāo)板30s混合液體；在室溫下孵育30分鐘，避免陽光直射。
8、每個測試孔加入100μL終止液。
9、輕微擺動酶標(biāo)板10s混合液體，450nm 下讀取每個孔的吸光度值（OD）。
G、結(jié)果分析
可以利用商業(yè)ELISA軟件程序比如Logit/Log or 4-Parameter 來評價ELISA結(jié)果。也可以通過計算每個標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0值，以%B/B0為y軸、魚腥藻毒素a濃度為x軸作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品濃度可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算。當(dāng)樣品中魚腥藻毒素a的濃度小于標(biāo)準(zhǔn)1（5ppb） 時，水樣結(jié)果即為<5ppb；當(dāng)樣品中魚腥藻毒素a的濃度大于標(biāo)準(zhǔn)4（500ppb）時，水樣結(jié)果即為>500ppb,。樣品需要進(jìn)一步稀釋后再測定。
H、操作數(shù)據(jù)
檢測限
魚腥藻毒素a的檢測限約為2.3 ng/mL(90% B/B0)。中間濃度約為87.4 ng/mL.(50% B/B0)，檢測值出于中間的位置比較可靠。
試劑盒的范圍是5 ng/mL 到500 ng/mL，如果所直接檢測的樣品的濃度在一個更低的范圍(0.25 ng/mL到25 ng/mL )，則需要進(jìn)行濃縮固相萃取，相關(guān)技術(shù)方法請咨詢我司。
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