PikoGreen dsDNA quantitation reagent
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 保存 | 價格(元) |
PikoGreen dsDNA quantitation reagent | D1101L1123 | 1ml | 4℃ | 1650 |
產(chǎn)品描述
PikoGreen是一種極為靈敏的雙鏈DNA熒光染料，于雙鏈DNA的定量。測定DNA濃度在cDNA文庫構(gòu)建、DNA亞克隆、PCR產(chǎn)物估測等領(lǐng)域中非常重要，另外疫苗等生物制品中殘留微量DNA的檢測因關(guān)系人身健康，顯得尤為重要。
相比傳統(tǒng)的方法，Pikogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下優(yōu)勢：①靈敏：數(shù)量級較UV吸光讀數(shù)更敏感，可節(jié)省樣品；②特異性強(qiáng)：只結(jié)合dsDNA，特異性強(qiáng)，不受樣品常規(guī)污染影響。傳統(tǒng)紫外吸光法容易受樣品中存在的單鏈DNA，蛋白，RNA等影響；③耐受性好：耐受較高濃度的鹽、尿素、乙醇、CHCl3、去垢劑、蛋白或瓊脂糖，可以直接定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物而無需從反應(yīng)混合物中純化DNA。④線性范圍寬：PikoGreen dsDNA染料測定DNA濃度，在100pg/ml-100ng/ml范圍內(nèi)呈良好線性；熒光計(jì)兼容。⑤容易使用：在樣品中加入染料，等待5-6分鐘染色，然后讀數(shù)即可，且適用于96和384孔板；與大多數(shù)基于熒光的酶標(biāo)儀和可適用于各種DNA樣品分析，PCR的分析、芯片樣品、DNA損傷分析、酶活性分析、基因組DNA定量以及復(fù)雜混合物中dsDNA的檢測和病毒DNA定量等多種領(lǐng)域。
PikoGreen僅與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出熒光，且所產(chǎn)生的熒光與DNA濃度呈正比，在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，可以選擇性地檢測低至25pg/ml的dsDNA。該分析在四個數(shù)量級范圍內(nèi)呈線性，且?guī)缀鯚o序列依賴性，可以精確地測量多個來源的DNA，包括基因組DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法因其穩(wěn)定性、靈敏性，已經(jīng)錄入《中國藥典》。
使用96孔板檢測，每次使用量200µl，則1ml PikoGreen定量試劑可以做2000次分析。PikoGreen以每管1ml的形式提供，Cat#D1101L1123。另外，李記生物特別研發(fā)了【Pikogreen dsDNA定量檢測試劑盒（Cat# D1101L1123）】方便客戶選用。
運(yùn)輸和保存方法
常溫運(yùn)輸。4℃避光干燥保存，有效期6個月。
使用方法
1. PikoGreen工作液的配制
使用前將PikoGreen dsDNA定量試劑回溫至室溫；PikoGreen是以100µL 200×的濃縮液形式保存于無水DMSO中的（共10管），實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求用1×TE按1:200 的比例稀釋適量定量試劑濃縮液。例如要準(zhǔn)備足夠的操作溶液以2ml檢測體系測定20個樣品，可向19.9mL 1×TE 中加入100μL PikoGreen dsDNA 定量試劑。工作液見光易降解，盡量在配好后幾小時內(nèi)使用。
2. 配制標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液
1) 用1 X TE溶液溶解dsDNA制備1μg/mL dsDNA 。根據(jù)在1cm 光程長度的比色杯中A260nm時的吸光度確定DNA 濃度；相應(yīng)于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。標(biāo)準(zhǔn)液常用小牛胸腺DNA制備，PikoGreen 試劑測定法在通常污染*的幾種復(fù)合物存在的條件下仍能保持線性良好，但是，為了得到有效的對照處理，被用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線的dsDNA 溶液要用和實(shí)驗(yàn)樣品相同的方式來處理，并且應(yīng)該包含相同的可能存在的污染物。
2) 制備從0.5ng/mL 到500ng/mL（見表1）單重復(fù)8 個點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中?；旌舷嗤w積的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作為空白對照,避光于室溫下放置2-5 分鐘。
表1: 用1 x 1cm 比色杯時DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃度配制參考
標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液濃度（ng/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液體積（mL） | PikoGreen 工作液體積（mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 終濃度(ng/mL) |
1000 | 1 | 1 | 500 |
200 | 1 | 1 | 100 |
50 | 1 | 1 | 25 |
20 | 1 | 1 | 10 |
5 | 1 | 1 | 2.5 |
2 | 1 | 1 | 1 |
1 | 1 | 1 | 0.5 |
0 | 1 | 1 | 空白 |
3) 當(dāng)用微量檢測皿適配器時，PikoGreen 測定也可在較低的測定體積（50μL 到200μL）內(nèi)完成。產(chǎn)生從1ng/mL 到100ng/mL（見表2）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，將至少50μL 溶液轉(zhuǎn)移到微量檢測皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部經(jīng)?？梢则?qū)散氣泡。避光于室溫下放置2-5 分鐘。
表2：用微量檢測皿DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃配制參考
標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液濃度（ng/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液體積（mL） | PikoGreen 工作液體積（mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 終濃度(ng/mL) |
200 | 30 | 30 | 100 |
50 | 30 | 30 | 25 |
20 | 30 | 30 | 10 |
5 | 30 | 30 | 2.5 |
2 | 30 | 30 | 1 |
0 | 30 | 30 | 空白 |
4) 孵育后用合適的熒光計(jì)測量樣品熒光值。Ex/Em=480nm/520nm，為了減少光漂白，應(yīng)保持所有樣品的檢測時間*。用熒光值zui大的樣品校正儀器。
5) 用檢測數(shù)據(jù)與DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 樣品分析
1) 用1 x TE 稀釋待測DNA 樣品至需要的體積（1x1cm 比色杯需1.0mL，微量檢測皿需25-100μL）。對樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被zui大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無法精確吸取的情況。
2) 在每個樣品中加入等體積PikoGreen 工作液，混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2-5 分鐘。
3) 檢測、讀取熒光值，換算樣品中dsDNA濃度?？梢詫悠愤M(jìn)行不同的稀釋處理重復(fù)測定以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。
注意事項(xiàng)
1) PikoGreen定量試劑含有DMSO，PikoGreen 是結(jié)合dsDNA，操作時采取適當(dāng)防護(hù)，戴手套小心操作；
2) 盡管常見污染物不會影響PikoGreen 檢測dsDNA濃度（見PikoGreen耐受污染物列表），但是當(dāng)樣品中dsDNA濃度太低，RNA, ssDNA濃度超過dsDNA 10倍以上時，RNA, ssDNA等污染還是會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大干擾，在此種情況下，RNA 酶可以消除RNA干擾, RNA 酶A、酶T1 、核酸酶S1 結(jié)合能除去ssDNA干擾，從而保證樣品熒光值是由dsDNA 產(chǎn)生。
附表：Pikogreen定量耐受的污染物列表
物質(zhì)名稱 | zui大耐受濃度 | 信號變化百分比 |
Salts |
Ammonium acetate | 50 mM | 3% decrease |
Sodium acetate | 30 mM | 3% increase |
Sodium chloride | 200 mM | 30% decrease |
Zinc chloride | 5 mM | 8% decrease |
Magnesium chloride | 50 mM | 33% decrease |
Urea | 2 M | 9% increase |
Organic Solvents |
Phenol | 0.1% | 13% increase |
Ethanol | 10% | 12% increase |
Chloroform | 2% | 14% increase |
Detergents |
Sodium dodecyl sulfate | 0.01% | 1% decrease |
Triton X-100 | 0.1% | 7% increase |
Proteins |
Bovine serum albumin | 2% | 16% decrease |
IgG | 0.1% | 19% increase |
Other Compounds |
Polyethylene glycol | 2% | 8% increase |
Agarose | 0.1% | 4% increase |
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