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實時熒光定量PCR（RT-qPCR）原理主要步驟
2023-9-25 閱讀(165)
實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針，當與擴增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時會發(fā)出信號，從而可以對目標序列進行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用。
RT-qPCR原理的反轉(zhuǎn)錄、PCR擴增及熒光實時檢測三個主要步驟：
1、反轉(zhuǎn)錄：
使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴增的DNA形式。
反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。
2、PCR擴增：
使用特定引物對cDNA進行PCR擴增，這些引物環(huán)繞目標區(qū)域。
PCR是一個循環(huán)過程，呈指數(shù)級擴增DNA模板的數(shù)量。
PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針，它們結(jié)合到擴增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號。
3、熒光實時檢測：
使用實時PCR儀器實時監(jiān)測熒光信號。
熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴增的DNA數(shù)量成比例。
使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標DNA量，從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。
