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PCR反應(yīng)循環(huán)步驟介紹
2023-12-18 閱讀(272)
PCR（polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應(yīng)）是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，用于擴(kuò)增DNA片段。它利用DNA聚合酶在模板DNA上的反復(fù)擴(kuò)增（涉及到三個(gè)步驟：變性、退火和延伸）來實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量特定的DNA序列。PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于基因檢測、病毒檢測、DNA測序等領(lǐng)域。
在變性步驟中，模板DNA被加熱以使其變性，即將其雙鏈DNA分離成兩條單鏈DNA。在退火步驟中，引物與模板DNA結(jié)合形成一個(gè)雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。在延伸步驟中，聚合酶沿著模板DNA鏈合成新的單鏈DNA，從而擴(kuò)增特定的DNA片段。
PCR需要經(jīng)過以下循環(huán)：
1.初始化步驟。這僅對熱啟動(dòng) PCR 不可少。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時(shí)間取決于所使用的聚合酶。
2.變性步驟。DNA是雙鏈分子，DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應(yīng)混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時(shí)進(jìn)入 PCR 循環(huán)。
3.退火步驟。變性后，反應(yīng)混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降低到50-65℃時(shí)，引物會(huì)與模板序列匹配，互補(bǔ)堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約 20-40 秒以全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始 DNA 組裝。
4.伸長步驟。在此步驟中，DNA 聚合酶開始合成 DNA，因此溫度應(yīng)為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時(shí)效果更好。這一步與體內(nèi)DNA復(fù)制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補(bǔ)，最終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時(shí)間取決于目標(biāo) DNA 片段的長度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說，DNA 聚合酶每 60 秒產(chǎn)生一千個(gè)堿基。
