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上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
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免疫熒光技術(shù)(IF)主要操作步驟
2024-3-4 閱讀(57)
免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence，IF）又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展最早的一種，它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，通過(guò)將抗體與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理先將已知抗體標(biāo)上英光素以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光從而可確定組織中某種抗原的定位進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣。
免疫熒光技術(shù)主要步驟:
1、冰凍切片制備:建議用新鮮組織否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等防止裂片和脫片。
2、組織切片固定切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min,尤其要較長(zhǎng)時(shí)間保存的白片,一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。
3、血清封閉:為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合需要在一抗孵音前先用血清(與二抗來(lái)源一致)封閉減弱背暴著色，血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的一般10-30min。
4、一抗孵音條件在免疫組化反應(yīng)中最重要包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵查溫度有幾種4度、室溫。
37度其中4度效果更佳孵音時(shí)間這與溫度、抗體濃度有關(guān)一般37度1-2h4度過(guò)夜(從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min)。具體條件還要摸索。
5、二抗孵育條件一般室溫或37度30min-1h具體時(shí)間需要摸索而濃度一般有工作液若是濃縮液還要摸索濃度一定要避光反應(yīng)，但在免疫熒光中我們一般先把三抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下然后去摸索一抗?jié)舛群桶钣龝r(shí)間。最后熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)可能會(huì)有大星的游商熒光素殘留需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)纳绦摹?br/>
6、復(fù)染目的是形成細(xì)胞輪廊從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，一般常用DAPI復(fù)染。
7、封片:為了長(zhǎng)期保存我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角,接近封片液近端的拐角先降低直至接觸到液體時(shí)為止當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)則可以緩慢降低另一拐角這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。
8、切片清洗:為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗(延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù))尤為重要一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次而一抗孵育后的清洗均為5次*5min.
注意事項(xiàng):
(1)單獨(dú)沖洗,防止交叉反應(yīng)造成污染。
(2)溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式。
(3)沖洗的時(shí)間要足夠,才能全洗去結(jié)合的物質(zhì)。
(4)PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求(建議PH在7.4-7.6,濃度是0.01M;中性及弱堿性條件有利于免疫復(fù)合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成,而高離子強(qiáng)度則有利于分解。
9、拍照有條件的話更好立即拍照若不能及時(shí)拍照也要封好片和用指甲油封固,保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書要求進(jìn)行操作不要隨意改變程序應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查防止紫外線對(duì)眼睛的攝害在調(diào)救光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡檢查時(shí)間每次以1~2h為宜超過(guò)90min.超高壓錄燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降熒光減弱標(biāo)本受紫外線照射3~5min后熒光也明顯減弱或褪色激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射,會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象:所以最多不得超過(guò)2~3h熒光顯微鏡光源壽命有限標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間,保護(hù)光源。天熱時(shí)應(yīng)加電扇散熱降溫新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再啟用時(shí)須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后標(biāo)本染色后立即觀察因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚之烯塑料袋中4℃保存可延緩熒光減弱時(shí)間,防止封裱劑蒸發(fā),使用的玻片等載體都必須厚度均勻無(wú)明顯的自發(fā)熒光如果使用油鏡還必須保證鏡油為無(wú)熒光鏡油電源更好裝穩(wěn)壓器,否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命也會(huì)影響鏡檢的效果。
