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ELISA實驗假陽性和假陰性結(jié)果對策
2024-4-8 閱讀(72)
ELISA檢測是一種免疫檢測方法，通常用于測量生物樣品中的抗體或抗原，包括蛋白質(zhì)或糖蛋白。像其他免疫檢測法一樣，它們依靠抗體與目標(biāo)的結(jié)合來促進(jìn)檢測。
ELISA實驗假陽性和假陰性結(jié)果對策：
1、標(biāo)本的采集與保存
1.1 當(dāng)標(biāo)本采集保存不當(dāng)產(chǎn)生溶血時，紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質(zhì)，其通過吸附或“PP效應(yīng)"（蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象）結(jié)合后，可催化A、B液顯色而造成假陽性
1.2 標(biāo)本采集保存不當(dāng)致細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；標(biāo)本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清IgG聚合，易使間接法的試驗本底加深。因此，標(biāo)本宜在新鮮時檢測。
1.3 反復(fù)凍融血清會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存做多次檢測，宜少量分裝凍存。
2、加樣
2.1 如果 樣品稀釋液少加或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG只占IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異性IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規(guī)定的稀釋倍數(shù)，極易造成高值陰性。反之，造成假陰性。
2.2 如果加入的酶結(jié)合物過多或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。
2.3 如果血液未開始凝固或凝固不全時就強行離心分離血清，此時的血清中仍留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果。
3.溫育
3.1 由于ELISA試驗在一定溫度下的反應(yīng)時間并不是反應(yīng)的終點，溫育時間過短、溫度過低，易致顯色不全；溫育時間過長、溫度過高，易致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗全，產(chǎn)生陰性高值或假陽性反應(yīng)。因此，要嚴(yán)格按規(guī)定的溫度和溫育時間進(jìn)行。
3.2 由于水浴較難將溫度控制在穩(wěn)定的范圍，因此我們每次試驗時應(yīng)認(rèn)真觀察水浴箱的溫度，盡量少開啟水浴箱門，嚴(yán)格控制水浴的溫度為37±0.5。同時，微孔板不可重疊放置，以保證傳熱均勻，各板的溫度都能迅速達(dá)到平衡。
3.3 由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37度，在這個溫度下溫育一定時間，蒸發(fā)的水分會很多，對于整個反應(yīng)體系來講，各種反應(yīng)物的濃度會不斷地增加，這樣必會導(dǎo)致反應(yīng)最后的值升高。因此溫育時應(yīng)貼上封板膠。
4.洗板
洗板在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻是決定試驗成敗的關(guān)鍵。ELISA就是靠洗板來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，通過洗板以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗板時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌。洗板如不全，有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標(biāo)記抗體作用而產(chǎn)生干擾。
4.1 各廠家的洗液是根據(jù)各自試劑的條件配制的，因此采用不配套的洗液常會得到不正常的反應(yīng)結(jié)果，包括本底升高，所以不同廠家的洗液不應(yīng)混用。
4.2 洗液應(yīng)按規(guī)定的倍數(shù)稀釋使用。試劑盒提供的洗液是濃縮的，過多稀釋洗液，會影響洗液的效果，而使反應(yīng)的本底升高。反之造成假陰性。
4.3 稀釋洗液的水應(yīng)該是新鮮的蒸餾水，電導(dǎo)率小于1.5us/cm。如果水中含有過多的鈣、鎂離子，這些離子會占用表面活性劑，使試驗本底增高。
