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上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
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傳代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方法
2021-9-7 閱讀(214)
1 、原理
體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。
細(xì)胞“一代"指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中，細(xì)胞培增3～6次。細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過三個(gè)階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。
常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)／100個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％，腫瘤細(xì)胞可達(dá)3～5％。細(xì)胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好時(shí)期，稱指數(shù)增生期(對數(shù)生)，適宜進(jìn)行各種試驗(yàn)。
2 、操作
①．將長成單層的原代培養(yǎng)細(xì)胞或HeLa細(xì)胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液。(以液面蓋住細(xì)胞為宜)，靜置5～10分鐘。
②.在倒置鏡下觀察被消化的細(xì)胞，如果細(xì)胞變園，相互之間不再連接成片，這時(shí)應(yīng)立即
在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細(xì)胞懸液。
?、郏畬⒓?xì)胞懸液吸出2ml左右，加到另一個(gè)培養(yǎng)瓶中并向每個(gè)瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
3 、結(jié)果
一般情況，傳代后的細(xì)胞在2小時(shí)左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代。
器材及液體的準(zhǔn)備和無菌操作的注意事項(xiàng) ：
1）、 器材和液體的準(zhǔn)備
細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材，如：培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時(shí)干烤滅菌后備用；手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅，20分鐘蒸氣滅菌；MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負(fù)壓抽濾后備用。
2）、 無菌操作中的注意事項(xiàng)
在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔。為此，在操作前要認(rèn)真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分鐘起動(dòng)超凈臺吹風(fēng)。操作時(shí)，嚴(yán)禁說話，嚴(yán)禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養(yǎng)瓶要在超凈臺內(nèi)才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內(nèi)完成。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端，將頂端在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然后再去吸取液體。總之，在整個(gè)無菌操作過程中都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行。
