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Orgami（DE3）plysS大腸桿菌

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Orgami（DE3）plysS大腸桿菌Origami系列菌株是K-12細(xì)胞的衍生菌，在trxB和gor基因上同時(shí)含有突變，這使得該菌株能夠更加高效的在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生成二硫鍵，有助于含二硫鍵蛋白的活性蛋白形成。Origami系列菌株的感受態(tài)細(xì)胞能夠用于氨芐抗性質(zhì)粒的蛋白表達(dá)，尤其是和pET32a載體能夠*搭配使用。pET32a載體含有thioredoxin （TRX）融合標(biāo)簽，能夠高效提升胞質(zhì)內(nèi)蛋白

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Orgami(DE3)plysS大腸桿菌

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Orgami(DE3)plysS大腸桿菌	1管	詢(xún)價(jià)

Origami系列菌株是K-12細(xì)胞的衍生菌，在trxB和gor基因上同時(shí)含有突變，這使得該菌株能夠更加高效的在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生成二硫鍵，有助于含二硫鍵蛋白的活性蛋白形成。Origami系列菌株的感受態(tài)細(xì)胞能夠用于氨芐抗性質(zhì)粒的Orgami(DE3)plysS大腸桿菌蛋白表達(dá)，尤其是和pET32a載體能夠*搭配使用。pET32a載體含有thioredoxin (TRX)融合標(biāo)簽，能夠高效提升胞質(zhì)內(nèi)蛋白二硫鍵的形成。DE3是溶源性的λDE3，在lacUV5啟動(dòng)子下攜帶有T7 RNA聚合酶的染色體拷貝。該菌株適用于pET系列載體及其他T7啟動(dòng)子系列載體。菌株含有的pLSs質(zhì)粒能夠產(chǎn)生T7溶菌酶，可以有效降低目的基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平。pLySs質(zhì)粒使得該菌株具有氯霉素抗性。pLySs質(zhì)粒的起始復(fù)制位點(diǎn)是p15 Origin, 這使得該質(zhì)粒能夠和pUC-及pBR322-衍生的質(zhì)粒互相共存。
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，Orgami(DE3)plysS大腸桿菌離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層(無(wú)色)主要為RNA，有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
3、PCR擴(kuò)增;
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進(jìn)行。
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。
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