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更新時(shí)間：2018-06-15 13:38:35瀏覽次數(shù)：406次
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鎳柱介質(zhì)基于His-Ni親和層析的蛋白質(zhì)純化方法是目前分離純化重組表達(dá)蛋白質(zhì)的重要方法，其原理是用基因重組的方法使待純化蛋白的N端或C端攜帶一段His序列（一般是6個(gè)His），然后利用偶聯(lián)了Ni離子的瓊脂糖與His的親和作用而將His-標(biāo)記蛋白與其他蛋白質(zhì)分開，與Ni-瓊脂糖結(jié)合的蛋白后用咪唑溶液洗脫即可。本產(chǎn)品就是專門用于純化帶有His標(biāo)記的蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)，它具有下列特點(diǎn)：
鎳柱介質(zhì)
名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格 | 手冊(cè) |
鎳柱介質(zhì) | 2mL | 150元 |
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基于His-Ni親和層析的蛋白質(zhì)純化方法是目前分離純化重組表達(dá)蛋白質(zhì)的重要方法，其原理是用基因重組的方法使待純化蛋白的N端或C端攜帶一段His序列（一般是6個(gè)His），然后利用偶聯(lián)了Ni離子的瓊脂糖與His的親和作用而將His-標(biāo)記蛋白與其他蛋白質(zhì)分開，與Ni-瓊脂糖結(jié)合的蛋白后用咪唑溶液洗脫即可。本產(chǎn)品就是專門用于純化帶有His標(biāo)記的蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，非常方便。
2. 介質(zhì)為交聯(lián)的瓊脂糖，可以反復(fù)使用。
3. Ni偶聯(lián)牢固，含有5個(gè)Ni螯合位點(diǎn)，Ni密度達(dá)到20-40 μmol/mL。
4. 結(jié)合量大，每mL介質(zhì)可以結(jié)合20-30 mg的蛋白質(zhì)。
5. 專一性強(qiáng)，一次過柱即可獲得純度高達(dá)95%的His-標(biāo)記蛋白。
6. 有效pH范圍廣，在pH3-11之間均可使用。
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA，有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
3、PCR擴(kuò)增;
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進(jìn)行。
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
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