1. 抗原的制備：
標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇：所用的菌種傷寒桿菌H901和傷寒桿菌O901應(yīng)具有典型形態(tài)菌落及生化反應(yīng)。在生理鹽水中不發(fā)生自身凝集，與特異血清有高度凝集者可作為菌種。
2. 菌液的制備
1) 原液制備：
H菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株接種于普通瓊脂的克氏瓶或大試管內(nèi) 37℃孵育18—24小時。肉眼觀察有無雜菌生長，必要時作鏡檢。用無菌甲醛生理鹽水洗下菌苔，將洗下液體裝入無菌試管內(nèi)，置37℃恒溫箱18—24小時以殺菌。得到原液。用作無菌試驗(yàn)即將菌液接種于肉湯及瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)4天，無活菌生長者才可使用。
O菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株依上法培養(yǎng)后，用無菌0.5%石灰酸鹽水將菌苔洗下，洗液裝入無菌試管置于37℃溫箱中18—24小時殺菌得原液。經(jīng)檢查無菌時可以使用(如無傷寒桿菌O菌株也可用H菌株制備O抗原。即用0.5%石灰酸生理鹽水洗下H菌菌液置100℃水浴60分鐘，破壞其H抗原即為O菌液。
2) 應(yīng)用液的制備：
合格的原液用標(biāo)準(zhǔn)比濁管計算含菌落數(shù)目后，用生理鹽水稀釋至每毫升含菌10億。是為了應(yīng)用液加入適量甲醛使其為0.25%，制備好的原液及應(yīng)用液均保存在2—10℃冰箱中備用，有效期為1年。
菌液濃度的計算及稀釋法：
菌液的濃度可用麥克倫特氏標(biāo)準(zhǔn)比濁法來測定，方法如下：
a. 分別配制1%硫酸溶液及1%氯化鋇溶液
b. 取口徑相等質(zhì)地相同的試管10支，依下表所示分別將硫酸及氯化鋇溶液加入，封固管口，注明號碼備用。
管號123456789101%BaCl2(ml)0.10.20.30.40.50.60.70.80. 91.0
1%H2SO4(ml)9.99.89.79.69.59.49.39.29.19.0相當(dāng)菌數(shù)(億/ml)36912151821242730
c. 將洗下的細(xì)菌原液放入與比濁管相同的試管中并予以一定稀釋。與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相比較，視其濁度相當(dāng)于比濁管的第幾管，然后將比濁管相當(dāng)菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即可得到每毫升中所含細(xì)菌的數(shù)量。如細(xì)菌原液1：5稀釋后其濁度與第3管相當(dāng)，則原液每毫升含菌數(shù)為9ⅹ5=45億。
d. 菌液的稀釋
3．免疫方法
1) 選擇體重2—3千克的健康雄兔2—3只，由耳靜脈采血1毫升，分離血清。與進(jìn)行免疫用的細(xì)菌做凝集試驗(yàn)，測定有無天然凝集素。如無或微量時，該動物可用于免疫。
2) 將已稀釋的抗原按以下劑量及程序注入兔耳靜脈。
日期第1天第5天第10天第15天第20天
注射劑量0.5ml、1ml1、5ml、2ml、2.5ml
3) 末次注射后7天耳靜脈采血1毫升，分離血清。用上述菌液作試管凝集試驗(yàn)，滴定抗菌血清中抗體的效價，效價在1：2000以上可放血。若效價不高可再增量注射菌液1—2次，再行試血。試血合格可頸動脈放血(方法見附錄)。分離血清，加入防腐劑(如萬分之一的硫化汞)放4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
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