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β-葡萄糖苷酶(β-GC)試劑盒,微板法

β-葡萄糖苷酶(β-GC)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase, β-GC）試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS2250W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： β-葡萄糖苷酶（β-GC，EC 3.2.1.21）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化水解β-D-葡 萄糖鍵，與植物細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過程中壁的松弛和加固有關(guān)，也與植物細(xì)胞的識(shí)別和一些信號(hào)分子的產(chǎn)生有 聯(lián)系。 β-葡萄糖苷酶（β-GC）可以水解對(duì)-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基*酚（PNP），后者在 405nm 有吸收峰，通過測(cè)定吸光值升高速率來計(jì)算β-葡萄糖苷酶活性。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前加 2.5mL 蒸餾水溶解，4℃保存 試劑二 液體 8mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體32mL×1瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、β-葡萄糖苷酶（β-GC）的活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的果實(shí)樣本取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行 冰浴勻漿。15000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000 rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例 進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 405nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 10 10 試劑一 40 蒸餾水 40 試劑二 50 50 迅速混勻，37℃保溫 30min 試劑三 300 300 混勻， 取 200μL 至 96 孔板中，405nm 處測(cè)定吸光值 A， ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】若ΔA 較小，可以增加 37℃保溫反應(yīng)時(shí)間（如 1 小時(shí)）,或者增加樣本上樣量（如增至 30μL，本試劑盒僅供科研使用 2 則試劑二相應(yīng)減少），則改變后的反應(yīng)時(shí)間 T 或加樣體積 V1 需重新代入計(jì)算公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.029x - 0.0143；x 是 PNP 摩爾質(zhì)量（nmol）， y 是△A。 2、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚（PNP）定義為一個(gè)酶活性單位。 β-GC 活性(nmol/min/mg prot)=[ (ΔA+0.0143) ÷0.029]÷(V1×Cpr)÷T=114.9×(ΔA+0.0143)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚（PNP）定義為一個(gè)酶活性單位。 β-GC 活性(nmol/min/g 鮮重)= [(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷(W×V1÷V)÷T=114.9×(ΔA+0.0143)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚（PNP）定義為一個(gè)酶活性 單位。 β-GC 活性(nmol/min/104cell) = [(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷(500×V1÷V)÷T =0.23×(ΔA+0.0143) 5、按液體體積計(jì)算： 單位定義：每毫升樣本每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基*酚（PNP）定義為一個(gè)酶活性單位。 β-GC 活性(nmol/min/mL)= [(ΔA+0.0143) ÷0.029]÷V1÷T=114.9×(ΔA+0.0143) V----加入提取液體積，1mL； V1----加入反應(yīng)體系中樣本體積，10μL=0.01mL； W----樣本質(zhì)量，g； 500----細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬； T----反應(yīng)時(shí)間，30min； PNP 對(duì)分子質(zhì)量----139.11。 Cpr----樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1ml 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 在 EP 管加入：10μL 標(biāo)準(zhǔn)品+40μL 蒸餾水+50μL 試劑二+300μL 試劑三，混勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下讀取吸光值。 4 根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。