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ADPG焦磷酸化酶,微板法

ADPG焦磷酸化酶,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase， AGP）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS6350W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： ADPG 焦磷酸化酶(AGP，EC 2.7.7.27)是植物淀粉合成過(guò)程中起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用的酶， 催化 l-磷酸葡萄糖(G-1-P)與三磷酸腺苷(ATP)反應(yīng)形成淀粉合成的直接前體腺苷二磷酸葡 萄糖(ADPG)，在植物中，主要存在于貯藏器官和葉片中。 AGP 催化的逆向反應(yīng)生成 G1P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖 脫氫酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，340nm 下測(cè)定 NADPH 增加速率，即可 計(jì)算 AGP 活性。 二、測(cè)試盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體120mL×1瓶 4℃保存 試劑一 粉體mg×1支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加1.1mL蒸餾水溶解，仍-20℃保存。 試劑二 粉體mg×1支 4℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加1.1mL蒸餾水溶解。仍4℃保存。 試劑三 液體13mL×1瓶 4℃保存 試劑四 粉體mg×1支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉體落入底部，再 加 2.1mL 蒸餾水溶解，仍-20℃保存。 【注】：粉劑量在 mg 級(jí)別，使用前用手甩幾次或者進(jìn)行離心，打開(kāi)直接加入要求的試劑即可。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.2g），加 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿， 12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：也可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 【注意】 若樣本顏色較深（如較深顏色的植物葉片），可引起起始值 A1 值較大如超過(guò) 1.5，可在樣本 制備過(guò)程中增加除色素步驟：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 80%乙醇冰浴勻漿， 12000rpm，4℃離心 10min，棄掉色素較深的上清液；以上除色素步驟重復(fù) 2 次。最后向離心得到的 沉淀中加入 1mL 提取液，混勻或再次冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。 ② 液體樣品：澄清的液體樣本直接檢測(cè)；若渾濁則離心后取上清液檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，設(shè)定溫度為 30℃。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃），在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 40 試劑一 10本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 10 試劑三 120 輕輕混勻，30℃孵育 10min。 試劑四 20 輕輕混勻，反應(yīng)開(kāi)始，30℃條件下，30S 在 340nm 處讀取 吸光值 A1，30min 后讀取 A2，△A=A2-A1。 【注】1. 若ΔA 在零附近徘徊，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T 至 60min 后或更長(zhǎng)讀取 A2；或加大樣本上樣量 V1（如增至 80μL，則試劑三相應(yīng)減少，保持總體積不變）；或增加樣本取樣質(zhì)量 W； 則改變后的 T 和 V1 以及 W 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算； 2. 若上升趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔 10S 讀取一次吸光值，選取一段線性上升的時(shí)間段來(lái)參與 計(jì)算，相對(duì)應(yīng)的 A1 和 A2 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 3. 若△A 的值大于 0.4，需縮減反應(yīng)時(shí)間 T（如減至 10min 或更短），或減少樣本上樣量 V1 （如減至 20μL，則試劑三相應(yīng)增加，保持總體積不變）；則改變后反應(yīng)時(shí)間 T 和 V1 需 代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白蛋白濃度計(jì)算 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活性單位。 AGP(nmol/min /mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=53.6×ΔA÷Cpr 2、按照樣本鮮重計(jì)算 酶活定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 AGP(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=53.6×ΔA÷W 3、按照液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 AGP(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T =53.6×ΔA ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm； V---加入提取液體積，1mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； d---比色皿光徑，0.5cm； T---反應(yīng)時(shí)間，30min； W---樣本質(zhì)量，g ； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。