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甘油三酯(TG)含量試劑盒,微板法

甘油三酯(TG)含量試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 甘油三酯（triglyceride, TG）含量測定試劑盒說明書 （貨號：WS0190W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 甘油三酯（TG）是三分子長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，不僅是細(xì)胞膜的主要成 分，也是重要呼吸底物。 甘油三酯（TG）被脂蛋白脂肪酶水解為甘油和游離脂肪酸。甘油接著被甘油激酶(GK) 的催化生成甘油-1-磷酸(G-1-P)。G-1-P 被甘油磷酸氧化酶(GPO)氧化生成過氧化氫 (H2O2)，(H2O2)與 4-氨基氨替吡啉等反應(yīng)生成紅色醌類化合物，其在 510nm 處有特征吸 收峰，通過檢測 510nm 處吸光值即可得出 TG 含量。 二、試劑盒的組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 100mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 2.2mL 蒸餾水，充分震蕩溶解備用。 試劑二 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部，再加 2.1mL 蒸餾水，充分震蕩溶解備用。 試劑四 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 液體 1mL×1 支 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液槍、水浴鍋、離心機(jī)、研缽、蒸餾水。 四、甘油三酯（TG）含量測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織樣本加入研缽中，加入 1mL 提取液，在冰上進(jìn)行勻漿，12000rpm，4℃ 或室溫離心 10min，取上清液待測。 【注】：若組織樣本為高脂樣本或部分為高脂樣本，需用無水乙醇進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃或室溫離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接測定，若渾濁則離心后取上清檢測。 2、上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 510 nm。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測定管 標(biāo)準(zhǔn)管 （僅做一次） 空白管 （僅做一次） 標(biāo)準(zhǔn)品 20 樣本 20 試劑一 20 20 20 試劑二 80 80 100 試劑三 20 20 20 試劑四 60 60 60 混勻，室溫（25℃）避光孵育 30min，于 510nm 讀取各管 A 值。 【注】1. 若測定管的 A 值大于 0.3，則可將樣本進(jìn)行稀釋（用提取液稀釋）或減少樣本加樣量 V1（如 減至 10μL，則試劑二相應(yīng)增加），稀釋倍數(shù) D 或樣本量 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2. 若樣本為血清，蛋黃（需用乙醇提?。┑雀?TG 樣本，可把樣本 V1 降為 2.5μL，另用 17.5μL 蒸餾水補(bǔ)齊，再按照上述加樣表操作測定，則改變后的 V1 需帶入公司計(jì)算。 3. 若樣本自身含有高的甘油背景值或者含有高的抗氧化物質(zhì)（如 VC 等），需要增設(shè)一個樣本 自身對照（即 20μL+100μL 試劑二+20μL 試劑三+60μL 試劑四，避光反應(yīng) 20min,510nm 讀 取吸光值 A），測定管減去對照管，代入計(jì)算公式計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本質(zhì)量計(jì)算： TG(μg/g 重量)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V2)×(A 測定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)÷(W×V1÷V) ×D =500×(A 測定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白) ÷W×D 2、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： TG(μg/104 cell)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V2)×(A 測定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)÷(500×V1÷V) ×D =(A 測定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白) ×D 3、液體中 TG 含量計(jì)算： TG(μg/mL)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V2) ×(A 測定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)÷V1×D =500×(A 測定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)×D TG(mmol/L)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V2) ×(A 測定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)÷V1÷Mr×D =0.782×(A 測定-A 空白)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)-A 空白)×D C 標(biāo)準(zhǔn)---標(biāo)品濃度，0.5mg/mL=500μg/mL； Mr---甘油三酯分子量，639； V---提取液體積，1mL； V1---樣本加入體積，0.02mL； V2---標(biāo)準(zhǔn)品加入體積，0.02mL； D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； 500---細(xì)胞數(shù)量； W---樣本取樣質(zhì)量，g。