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1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)試劑盒,微板法

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS4011W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是植物體內(nèi)脯*酸生物合成的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是植 物在遭受脅迫時(shí)脯*酸合成的限速酶；脯*酸作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，與植物對(duì)干旱和 鹽脅迫的適應(yīng)性密切相關(guān)。所以 P5CS 在調(diào)節(jié)脯*酸的代謝水平上具有重要作用。 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）催化谷*酸轉(zhuǎn)化成γ-谷*酸半醛，同時(shí)使 NADPH 氧化成 NADP+，通過(guò)檢測(cè) NADPH 在 340nm 處的下降速率，即可得出 P5CS 酶活性大小。 二、試劑盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 粉體 mg×2 支 -20℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 每支分別加入 0.6mL 用，用不完的試劑分裝后 蒸餾水溶解備 -20℃保 存，禁止反復(fù)凍融，三天內(nèi)用完。 試劑三 液體 13mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉體 mg×2 支 4℃保存 臨用前甩幾下，使粉體落到底部， 再加入 1.1mL 蒸餾水溶解備用。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。 四、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣本情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、 樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取上清液待用。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：澄清的液體樣本直接檢測(cè)，若渾濁則離心后取上清檢測(cè)。 2、 上機(jī)檢測(cè)： 1 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm。 2 所有試劑解凍至室溫。 3 制備對(duì)照管樣本：取出同一個(gè)樣本的部分上清液至一新 EP 管中，于 95℃水浴中煮沸 10min 后取出，冷卻至室溫后于 12000rpm，4℃或者室溫離心 10min，取離心后的上 清液作為該樣本的對(duì)照管樣本備用。 4 在 96 孔板中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 40 40（煮沸的樣本） 試劑一 10 10 試劑二 10 10 試劑三 130 130 試劑四 10 10 混勻，室溫（25℃）下，30s 時(shí)立即于 340nm 處分別讀取 吸光值 A1，10min 后讀取 A2，△A=（A1-A2）測(cè)定-（A1-A2） 對(duì)照（每個(gè)樣本需做一個(gè)自身對(duì)照）。 【注】1. 若ΔA 的值在零附近徘徊，則可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 40min 或更長(zhǎng)），或加大樣本 量 V1（如增至 60μL，則試劑三相應(yīng)減少），則改變后的反應(yīng)（孵育）時(shí)間 T 或加樣體 積 V1 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2. 若起始值 A1 太大如超過(guò) 2（如顏色較深的植物葉片，一般色素較高，則起始值相對(duì) 會(huì)偏高），可以適當(dāng)減少樣本加樣量（則試劑三相應(yīng)增加），則改變后的加樣體積需代 入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白在每分鐘內(nèi)氧化 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 P5CS 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=160.8×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 P5CS 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=160.8×ΔA÷W 3、按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活單位（U）。 P5CS 活性(nmoL/min /104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.322×△A 4、液體中 P5CS 活力的計(jì)算： 單位定義：每毫升液體在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 P5CS 活性(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=160.8×ΔA V---提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL； V2---反應(yīng)體系總體積：2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； T---反應(yīng)時(shí)間，10min； W---樣本質(zhì)量，g； ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm； Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。