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乙酰酯酶（AE）活性檢測(cè)試劑盒,微板法

乙酰酯酶（AE）活性檢測(cè)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 乙酰酯酶（Acetylesterase，AE）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào)：WS8170W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 乙酰酯酶（EC 3.1.1.6，AE）已被證明是消除飼料細(xì)胞壁中阿魏酸等酚酸類(lèi)木質(zhì)素的關(guān) 鍵酶?？膳c其他細(xì)胞壁降解酶協(xié)同作用共同促進(jìn)飼料等細(xì)胞壁的降解。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱(chēng) 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑×2 支 4℃保存 臨用前每支加 0.6mL 無(wú)水乙 醇混勻溶解，仍 4℃保存。 試劑三 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、蒸餾水。 四、乙酰酯酶（AE）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰 浴勻漿，4℃×12000rpm 離心 15min，取上清液待測(cè)。 【注】:若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或 細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：可直接測(cè)定，或者適當(dāng)稀釋后測(cè)定。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)為 405nm。 ② 所有試劑于 25℃水浴中預(yù)熱 10 min。 ③ 在 EP 管中依次加入下列試劑： 試劑名稱(chēng)（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 100 100 試劑一 220 240 試劑二 20 混勻，40℃孵育 30min。 試劑三 60 60 混勻，取 200μL 上清液至 96 孔板中（若有渾濁可 8000rpm 離心 5min 后取上清），于 405nm 讀取 A 值， ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照）。 【注】：① 若ΔA 的值非常低在零附近，可增加樣本量 V1（如增至 150μL，則試劑一相應(yīng)減少） 或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 60min 或更長(zhǎng)），則重新調(diào)整的 V1 和 T 代入公式重新計(jì)算。本試劑盒僅供科研使用 2 ② 若△A 的值超過(guò) 1，則需要稀釋樣本，稀釋倍數(shù) D 代入計(jì)算公式； 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.0249x - 0.0042，x 是 PNP 摩爾質(zhì)量（nmol）；y 是△A。 2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：每克組織每分鐘水解底物產(chǎn)生 1nmol PNP 定義為一個(gè)酶活單位。 AE (nmol/min/g 鮮重)=[(△A+0.0042)÷0.0249]÷(W×V1÷V)÷T×D=13.4×(△A+0.0042)÷W×D 3、按照樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解底物產(chǎn)生 1nmol PNP 定義為一個(gè)酶活單位。 AE (nmol/min/mg prot)=[(△A+0.0042)÷0.0249]÷(Cpr×V1)÷T×D =13.4×(△A+0.0042)÷Cpr×D 4、按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解底物產(chǎn)生 1nmol PNP 定義為一個(gè)酶活單位。 AE (nmol/min/104 cell)=[(△A+0.0042)÷0.0249]÷(500×V1÷V)÷T×D =0.03×(ΔA+0.0042)×D 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：每毫升液體每分鐘水解底物產(chǎn)生 1nmol PNP 定義為一個(gè)酶活單位。 AE(nmol/min/mL)=[(△A+0.0042)÷0.0499]÷V1÷T=13.4×(△A+0.0042) W---樣品質(zhì)量，g； V---提取液體積，1 mL； V1---上清液體積（mL），0.1mL； T---反應(yīng)時(shí)間，30 min。 D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； 500---細(xì)胞數(shù)量，萬(wàn)； Cpr---上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmol/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1.4ml 蒸餾水超聲溶解。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2 μmol/ml。也可根 據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)對(duì)照管的加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。