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NAD激酶(NADK)試劑盒,微板法
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【簡單介紹】
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NAD激酶(NADK)試劑盒,微板法
NADK(EC 2.7.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前所發(fā)現(xiàn) 的生物體內(nèi)惟一能夠催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶

NAD激酶(NADK)試劑盒,微板法

NAD激酶(NADK)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 NAD 激酶(NAD kinase, NADK)試劑盒說明書 (貨號:WS4580W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡介: NADKEC 2.7.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前所發(fā)現(xiàn) 的生物體內(nèi)惟一能夠催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶,因此,NAD 激酶在合成 NADP(H) 以及調(diào)節(jié) NAD(H)NADP(H)的平衡上具有重要作用。 NADK 催化 NAD+磷酸化生成 NADP+;接著在 6-磷酸葡萄糖脫氫酶和 6-磷酸葡萄糖作 用下,使 NADP+還原成 NADPH。通過檢測 NADPH 340 nm 下的增加速率??傻贸?NADK 酶活性的大小。 二、試劑盒的組成和配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 120mL×1 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心使粉劑落 入底部,再加 1.1mL 蒸餾水溶 解。 試劑二 粉劑 mg×1 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心使粉劑落 入底部,再加 1.1mL 蒸餾水溶 解。 試劑三 液體 16mL×1 4℃保存 試劑四 粉劑 mg×1 4℃保存 臨用前甩幾下或離心使粉劑落 入底部,再加 1.1mL 蒸餾水溶 解。 三、所需的儀器和用品: 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、蒸餾水。 四、NAD 激酶(NADK)活性測定: 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個樣本做預(yù)測定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)! 1、樣本制備: ① 組織樣本 稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液,進(jìn)行冰浴勻漿。4×12000g 離心 10min,取上 清,置冰上待測。 【注】:若增加樣本量,可按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本: 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;取 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液; 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,300W,超聲 3s,間隔 7s,重復(fù) 30 次); 4×12000g 離心 10min,取上清,置冰上待測。 【注】:若增加樣本量,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例進(jìn)行提取 ③ 液體樣本:直接檢測,若渾濁則離心后取上清液檢測。 2、上機(jī)檢測: ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 340nm。 ② 所有試劑解凍至室溫(25℃) ③ 在 96 孔板中依次加入下列試劑:本試劑盒僅供科研使用 2 試劑名稱(μL測定管 樣本 10 試劑一 10 試劑二 10 試劑三 160 混勻,25℃下孵育 5-10min 試劑四 10 混勻,25℃下立即于 340nm 處讀取 A1,2min 后讀 A2,△A=A2-A1。 【注】1. 若 A2 值大于 1.5,則可減少樣本上樣量 V1(如減至 5μL,則試劑三相應(yīng)增加),或縮短 反應(yīng)時間 T(如縮至 1min 或更短),則改變后的加樣量 V1 和反應(yīng)時間 T 需代入公式重新計(jì)算。 2. 若△A 在零附近徘徊,可增加樣本量(如增至 20μL,則試劑三相應(yīng)減少),或增加反應(yīng)時 間 T(如增至 5min 或更長)。則改變后的加樣量 V1 和反應(yīng)時間 T 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算: 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算: 酶活定義:每毫克組織蛋白每分鐘生成 1μmol NADP+定義為一個酶活力單位。 NADKμmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷ε×d×106]÷(V1×Cpr) ÷T=3.22×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算: 酶活定義:每克組織每分鐘生成 1μmol NADP+定義為一個酶活力單位。 NADKμmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V2÷ε×d×106]÷(W× V1÷V) ÷T=3.22×ΔA÷W 3、按細(xì)菌/細(xì)胞密度計(jì)算: 酶活定義:每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1μmol NADP+定義為一個酶活力單位。 NADKμmol/min /104 cell)=[ΔA×V2÷ε×d×106]÷(500×V1÷V) ÷T=0.006×ΔA 4、按液體樣本計(jì)算: 酶活定義:每毫升液體每分鐘生成 1μmol NADP+定義為一個酶活力單位。 NADKμmol/min/mL)=[ΔA×V2÷ε×d×106]÷V1÷T=3.22×ΔA ε---NADPH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/mol/cm; d---96 孔板光徑,0.5cm; V---加入提取液體積,1 mL; V1---加入樣本體積,0.01 mL; V2---反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LT---反應(yīng)時間,2 min; W---樣本質(zhì)量,g; 500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬; Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。



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