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NADH氧化酶(NOX)試劑盒,微板法
NADH氧化酶(NOX)試劑盒,微板法
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【簡(jiǎn)單介紹】
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NADH氧化酶(NOX)試劑盒,微板法
NADH 氧化酶(NOX,EC 1.6.99.3)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中, 可在氧氣存在下,直接將 NADH 氧化為 NAD。

NADH氧化酶(NOX)試劑盒,微板法

NADH氧化酶(NOX)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 NADH 氧化酶(NADH oxidase,NOX)試劑盒說(shuō)明書(shū) (貨號(hào):WS3080W 微板法 96 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介: NADH 氧化酶(NOXEC 1.6.99.3)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中, 可在氧氣存在下,直接將 NADH 氧化為 NAD。該酶不僅參與 NAD 的再生,而且與免疫 反應(yīng)密切相關(guān)。 NOX 能夠?qū)?NADH 氧化為 NAD,通過(guò)檢測(cè) NADH 340nm 處的下降速率,即可得 NADH 氧化酶活性的大小。 二、試劑盒組分與配制: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 試劑一 液體 100mL×1 -20℃保存 試劑二 液體 20mL×1 -20℃保存 試劑三 液體 16mL×1 4℃保存 試劑四 粉劑×1 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部,再加 1.5mL 蒸餾水溶解備用。 試劑五 粉劑×3 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底 部,每支再加 0.5mL 蒸餾水溶解 ,用不完的試劑分裝后-20℃保存, 禁止反復(fù)凍融,三天內(nèi)用完。 三、所需的儀器和用品: 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。 四、NADH 氧化酶(NOX)活性測(cè)定: 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)! 1、線粒體制備(提示:整個(gè)線粒體的提取過(guò)程須保持 4低溫環(huán)境)① 稱取約 0.2g 組織或收集 1000 萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞,加入 1mL 試劑一,用冰浴勻漿器或研缽冰 浴勻漿,轉(zhuǎn)移至離心管后于 4×3000g 離心 20min。 ② 小心吸取上清液(棄沉淀)移至另一離心管中,4×16000g 離心 20min。用移液器移 除上清液(上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 NOX(此 步可選做))。留下沉淀(沉淀即為線粒體)。 ③ 在沉淀(線粒體)中加入 200μL 試劑二,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超 5s,間隔 3s,重復(fù) 30 次),液體置于冰上用于線粒體 NOX 酶活性測(cè)定。 【注】:若增加樣本量,可按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例進(jìn)行提取,或按照細(xì) 菌/細(xì)胞數(shù)量(104):提取液(mL)為 500~1000:1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)1 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,設(shè)定溫度 25℃,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm。 2 所有試劑解凍至室溫(25℃)。 ③ 在 96 孔板中依次加入: 試劑名稱(μL測(cè)定管 試劑三 160 試劑四 10 試劑五 10本試劑盒僅供科研使用 2 混勻,室溫(25℃)靜置 3min 樣本 20 混勻,室溫(25℃)立即于 340nm 處讀 A1,5min 后讀取 A2,△A=A1-A2 【注】若△A 的值在零附近,可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T(如至 10min 或更長(zhǎng)),則改變后的 反應(yīng)時(shí)間 T 需代入公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算: 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算: 酶活定義:每毫克組織蛋白每分鐘氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位。 NOXnmol/min /mg prot=[ΔA÷ε×d×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=643.1×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算: 酶活定義:每克組織每分鐘氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活單位。 NOXnmol/min /g 鮮重)=[ΔA÷ε×d×V2×109]÷(W× V1÷V)÷T=128.6×ΔA÷W 3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算: 酶活定義:每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘氧化 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 NOXnmol/min /104 cell=[ΔA÷ε×d×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.26×ΔA ε---NADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L/mol/cm; d---96 孔板光徑,0.5cm; V--- 加 入 提 取 液 體 積 , 0.2mL ; V1--- 加 入 樣 本 體 積 , 0.02mL ; V2---反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L; T---反應(yīng)時(shí)間,5min; W---樣本質(zhì)量,g; 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn); Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。



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