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Mg2+- ATP 酶試劑盒
Mg2+- ATP 酶試劑盒
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更新時(shí)間:2024-06-20 16:12:50瀏覽次數(shù):577

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【簡(jiǎn)單介紹】
級(jí)別 其他
Mg2+- ATP 酶試劑盒
Mg2+-ATP 酶與細(xì)胞維持胞內(nèi) Mg2+濃度有關(guān), 可在運(yùn)輸 Mg2+的同時(shí)催化 ATP 水解生 成 ADP 和無(wú)機(jī)磷。通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量可確定該酶活性高低。

Mg2+- ATP 酶試劑盒

Mg2+- ATP 酶試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 Mg2+ - ATP 酶活性測(cè)定說(shuō)明書 (貨號(hào):WS0980F 分光法 24 樣) 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介: Mg2+-ATP 酶與細(xì)胞維持胞內(nèi) Mg2+濃度有關(guān), 可在運(yùn)輸 Mg2+的同時(shí)催化 ATP 水解生 ADP 和無(wú)機(jī)磷。通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量可確定該酶活性高低。 二、所需的儀器和用品: 可見(jiàn)分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿(光徑 1cm)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液 器、研缽、冰和蒸餾水。 三、試劑盒的組成和配制: 【注】:全程操作需無(wú)磷環(huán)境;試劑配置用新的槍頭和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿,避 免磷污染。 四、Mg2+-ATP 酶活性檢測(cè): 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定,了解本批樣品情況,熟悉實(shí)驗(yàn)流程,避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)! 1、樣本制備: ① 組織樣本: 稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液,進(jìn)行冰浴勻漿。 4℃×12000rpm 離心 10min,取 上清,置冰上待測(cè)。 【注】:若增加樣本量,可按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)1:5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本: 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 12000rpm 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。 【注】:若增加樣本量,可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量(104):提取液(mL)500~1000:1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本:直接檢測(cè);若渾濁,離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè): ① 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 700nm,蒸餾水調(diào)零。 ② 所有試劑解凍至室溫(25℃)。 ③ 在 EP 管中依次加入: 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 提取液 60mL×1 4℃保存 試劑一 粉體 mg×1 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部,再加 18mL 蒸餾水,混勻溶解備用。 試劑二 粉劑 mg×1 -20℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部,再加 9mL 蒸餾水,混勻溶解備用。 試劑三 液體 9mL×1 4℃保存 試劑四 A:粉體 mg×1 B:液體 1mL×1 4℃保存 臨用前向 A 試劑中加 1.35mL B 液, 再加 17.4mL 的蒸餾水,混勻溶解備用。 標(biāo)準(zhǔn)品 粉體 mg ×1 4℃保存 若重新做標(biāo)曲,則用到該試劑 試劑名稱(μL測(cè)定管 對(duì)照管 試劑一 300 300 試劑二 300本試劑盒僅供科研使用 2 ④ 顯色反應(yīng): 五、結(jié)果計(jì)算: 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y = 2.0283x - 0.0002,x 是標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量(μmol/mL, y A。 2、按蛋白濃度計(jì)算: 定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mg prot)=[(A+0.0002)÷2.0283×V2]÷(V1×Cpr)÷T=5.18×(A+0.0002)÷Cpr 3、按樣本鮮重計(jì)算: 定義:每小時(shí)每克組織分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/g 鮮重)=[(A+0.0002)÷2.0283×V2]÷(W×V1÷V)÷T=5.18×(A+0.0002)÷W 4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算: 定義:每小時(shí)每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/104 cell)=[(A+0.0002)÷2.0283×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.0104×(A+0.0002) 5、液體中 Mg2+-ATPase 活力計(jì)算: 定義:每小時(shí)每毫升液體分解 ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。 酶活力(μmol/h/mL)=[(A+0.0002)÷2.0283×V2]÷V1÷T=5.18×(A+0.0002) V---加入提取液體積,1mLV1---加入樣本體積,0.3mL ; V2---酶促反應(yīng)總體積,1.05mLT---反應(yīng)時(shí)間,1/3 小時(shí); W---樣本鮮重,g500---細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)。 Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。 附:標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程: 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液(5μmol/mL):標(biāo)準(zhǔn)品用 10mL 蒸餾水溶解。(母液需在兩天內(nèi)用)。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品:0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.42, 0.5. μmol/mL。也可根據(jù) 實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)顯色反應(yīng)階段測(cè)定管的加樣體系操作,根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 蒸餾水 300 樣本 300 300 37℃ 孵育 20min 試劑三 150 150 混勻,12000rpm,4℃離心 5min,上清液待測(cè) 上清液 450 450 試劑四 300 300 混勻,室溫靜置 10min,700nm 下讀取各管吸光值, A=A 測(cè)定-A 對(duì)照(每個(gè)樣本做一個(gè)自身對(duì)照)。



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