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上海雅吉生物科技有限公司
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細胞原代培養(yǎng)實驗
2019-5-22 閱讀(507)
實驗方法原理 將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實際上，通常把代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。
實驗材料 胎鼠新生鼠
試劑、試劑盒 1640培養(yǎng)基牛血清胰酶Hank’s液酒
儀器、耗材 培養(yǎng)箱培養(yǎng)瓶青霉素瓶小玻璃漏斗平皿吸管移液管紗布手術(shù)器械血球計數(shù)板離心機水浴箱
實驗步驟
一、實驗材料準備
1. Hank's液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hank's液可以高壓滅菌。4℃下保存。
二、具體操作
1. 將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和浸入體內(nèi)）再用酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。
2. 用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
3. 用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1 mm2），再用Hank's液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。
4. 視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。
5. 加入3-5 ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。
6. 靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
7. 1 000 rpm，離心10分鐘，棄上清液。
8. 加入Hank's液5 ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。
9. 加入培養(yǎng)液1-2 ml（視細胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。
10. 將細胞調(diào)整到5x105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25 ml細胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。
收起
注意事項
1. 自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。
2. 在超凈臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。
3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。
4. 操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
6. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。
7. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。
8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
