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上海雅吉生物科技有限公司
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大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗之CaCl2轉(zhuǎn)化法
2019-9-12 閱讀(5459)
實驗方法原理 細菌處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，質(zhì)粒DNA或重組DNA粘附在細菌細胞表面，經(jīng)過42°C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA，然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。
實驗材料 大腸桿菌
試劑、試劑盒 CaCl2氨芐青霉素LB
儀器、耗材 離心機分光光度計搖床
實驗步驟
1. 接種一個單菌落于50 ml LB培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)過夜（250 r/min）。
2. 往一個2 L 的燒瓶中加入400 ml LB培養(yǎng)液，再加入4 ml 過夜培養(yǎng)液，于37℃；搖床，培養(yǎng)至OD590為0.375。
3. 將培養(yǎng)液分裝到8個50 ml 預(yù)冷無菌的聚丙烯管中，于冰上放置5~10 min，然后于4℃，1 600 g 離心7 min。
4. 細胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重懸，于4℃，以1 100 g 離心5 min 。
5. 細胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重懸，冰上放置30 min，于4℃，1 100 g 離心5 min。
6. 用2 ml 冰冷的CaCl2溶液重懸各管細胞，然后按每管250 ul 的量分裝于預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，立即凍存于- 70℃。
7. 按照以下各步驟用10 ng pBR322轉(zhuǎn)化100 ul 感受態(tài)細菌。
8. 將合適體積的轉(zhuǎn)化物涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。
9. 將10 ng 加入到一個15 ml 無菌的圓底試管中，并放置冰上。
10. 將盛有感受態(tài)細胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。
11. 立即將100 ul 感受態(tài)細菌加 入到管中，輕輕旋動，并放置冰上10 min 。
12. 將管故入42℃水浴2 min 進行熱休克，然后加入1 ml LB 培養(yǎng)液于每一支試管中。
13. 于37℃置滾筒式搖床口培養(yǎng)1 h。
14. 將幾個稀釋度菌液涂布于含合適抗生素的平板上，于37℃培養(yǎng)12~16 h。
收起
注意事項
1.轉(zhuǎn)化菌涂平板前抗生素的量要足夠，涂布細菌時菌量不要太多，培養(yǎng)時間不要超過16小時。否則抗生素會失效，未轉(zhuǎn)化菌也會生長。
2.制備感受態(tài)細胞的過程中，每一步操作的動作要輕柔，尤其是懸浮細胞時要避免用旋禍混合器。
3.所用的CaCl2等試劑均需是純度的，并用純凈的水配制，分裝保存于4℃。
4.整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行。
